文献阅读---对β-三酮除草剂具有广谱抗性的一个水稻基因研究

本次精读Science杂志2019年7月Online的一篇Report短文，题目为：
A rice gene that confers broad-spectrum resistance to β-triketone herbicides
（对β-三酮除草剂具有广谱抗性的一个水稻基因研究）

本篇帖子重要的点：
（1）简介β-三酮除草剂类型
（2）简述和总结Report的研究内容和结果
（3）心得体会

1. 简介β-三酮除草剂类型

杂草使农业生产的效益降低。当前，由于除草剂的长期使用，很多杂草对除草剂已经出现了相应的抗药性。对羟基苯丙酮双加氧酶（HPPD: 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase）是除草剂的作用靶标之一，相关除草剂是研究热点。

1979年，第一个释放的HPPD除草剂是吡唑特。现在有多种HPPD抑制剂类除草剂被研发并投入生产，根据化学基团分类：异噁唑酮类，三酮类和吡唑酮类等，后两者在市场占比较多。根据文章中介绍，2019年主要的HPPD除草剂的市场份额如下，其中硝磺草酮为三酮类除草剂，苯唑草酮为吡唑酮类除草剂，由此可见，HPPD除草剂的实际应用价值很高，对农业生产意义深远¹。

2. 简述和总结Report的研究内容和结果

通过上面的介绍，我们简单了解了HPPD类除草剂，其中三酮类除草剂表现突出（硝磺草酮等），而本篇文献就是着重研究了三酮类除草剂的水稻抗性基因，通过图位克隆粗定位和精细定位，并借助仪器检测，对其抗除草剂的化学解毒过程进行验证，该抗性基因在未来生产应用方面表现出巨大潜力。

2.1 研究动机

Benzobicyclon (BBC，双环磺草酮，三酮类除草剂)为水稻除草剂，在使用中发现一些水稻品种会受到该除草剂的药害，这限制了该类除草剂在水稻田的使用，可能造成水稻和杂草都被杀死的情况。因此希望定位水稻抗BBC除草剂基因，并应用于未来的品种培育中，可以放心使用这类除草剂而不必担心产生药害，实现除草剂和抗性基因的完美结合。

2.2 研究材料和方法

水稻群体定位材料和染色体代换系、突变体材料NG6511 或 NF8046、谱系来源群体材料、拟南芥和水稻感性材料转基因验证；

QTL分析，Domain和序列分析，基因家族分析；

水培加入土壤和后期除草剂BBC、MS培养基、PCR，HPLC和LC-ESI-MS等方法。

2.3 研究结果

（1）定位除草剂抗性基因HIS1（Os02g028070）的定位
QTL的粗定位和精细定位，并寻找候选基因（Fig1. D）。基于Tachisugata (BBC resistant) 和 Momiroman (BBC sensitive)材料的BC1F2群体，使用GRAMENE (http://www.gramene.org)数据库中选择的121SSR标记进行粗定位。此外通过染色体代换系进行QTL分析，Habataki（BBC-sensitive indica cultivar）和 Koshihikari（BBC-resistant japonica cultivar 背景）。敏感材料KHSL04（Habataki segment of chr2 ）与Koshihikari杂交，产生的群体进行精细定位（high-resolution mapping/fine-mapping）（Fig1. B and C）。随后在chr2染色体上定位到一个敏感性相关的116.4kb 的QTL区间中，包含11个候选基因。

基于domain和核酸序列特征，猜测候选基因。Pfam的Motif分析发现Os02g028070基因序列中存在Fe(II)/2-oxoglutarate (2OG)–dependent oxygenases 的domain序列。此外，核酸序列分析感性材料的该基因（Os02g028070）第四个外显子IV上存在一个28-bp的无义突变（ORF改变，转录提前终止）。怀疑这个基因可能是BBC抗性的响应基因。

在突变体库中寻找该基因的佐证。在Tos17的突变体数据库中找到候选基因Os02g028070的几个突变体，其中NG6511 和NF8046，它们分别在外显子 I 和 V 中插入了反转录转座子 Tos17，在 BBC 处理下表现出白化药害表型（感性材料）（Fig1. E）。而未突变的日本晴表现出抗性特征，这进一步证明该基因很可能是响应基因。同时CK未添加除草剂的对照中，日本晴和两个突变体材料长势相似，由此推断该响应基因对于水稻的生长发育也是至关重要。

杂合体自交后代基因型和表型验证。通过杂合体材料的自交产生杂交后代，并对这部分后代进行基因型和表型的关联验证，发现表从基因型推断表型的相关性准确度为100%，同时也调查了对于其他三酮类除草剂的抗性，由此确认该基因Os02g028070是研究寻找的抗性基因，同时对磺草酮 (SLT)和硝磺草酮 (MST)三酮类除草剂存在抗性，而TFT除草剂下两个突变体未表现敏感性状，推测可能是存在该基因同家族基因表现为TFT抗性（Fig1. F and G）。
定位的基因命名为HIS1（Os02g028070）。

Note:
TFT是呋喃磺草酮(tefuryltrione)，属于苯甲酰基环己二酮类除草剂，非三酮类，但是同样作为在HPPD这个酶上起作用。

（2）HSL基因家族解析和转基因验证
在Fig1. G中观察到TFT除草剂下（非三酮类），该基因的突变体植株未表现感性，这些除草剂都是作用在HPPD靶标的，这表明可能存在潜在其他基因协助对除草剂进行了解毒，由此推断可能是包含该Domain的同一家族的其他基因，因而分析了这个家族结果（前人已经发表）。

HSL家族相对保守，经过前面鉴定的基因和报道的水稻HSL家族的序列比对，HIS1基因与OsHSL1相似度最高（87%）。三维同源建模表明这两个蛋白共享双链 β-螺旋折叠（均存在），是这个家族的典型特征。非禾本科单子叶植物和双子叶植物中也都存在相对保守的HSL基因，表明这类基因在植物是存在这通用的功能。基于公共表达数据库，对两个基因的表达量调查，并使用RT-PCR验证，结果表明HIS1是在叶片中高表达，而OsHSL1在除了根中几乎均表达量较高。

为了验证HIS1和OsHSL1在水稻中的作用。作者构建了水稻和拟南芥的表达载体，对两个基因进行遗传转化。水稻中：转化HIS1的材料中比日本晴的抗性增加，而且对其他的三酮除草剂也是存在抗性；拟南芥中：转化HIS1的抗性比OsHSL1的抗性更强，拟南芥转HIS1的植株均能抗三酮类除草剂，转化OsHSL1基因的没有BBC抗性，但对TFT抗性增加了。
结果表明：这些结果表明 HIS1 可能应用于培育对多种 bTH 具有抗性的作物。

值得注意的是：HIS1 突变水稻品系显示对 TFT 的抗性，但对 MST 和 SLT 以及 BBC 敏感（Fig. 1G），表明 OsHSL1 可能与 HIS1 一起促进了自然状态下水稻的 TFT 抗性。

至此，进一步确认了HIS1基因的转基因表型，同时挖掘到同家族的OsHSL1这个基因存在TFT抗性，二者共同响应TFT除草剂。

（3）候选基因的育种历史
基于已知系谱的水稻材料，通过PCR鉴定其中是否存在28-bp的无义突变，由此追溯该突变的历史。结果表明，该突变来源于Peta这个indica祖先，而存在这个突变的材料（PCR鉴定）确实都是除草剂感性材料（Fig. S1 C, E and F）。Tadukan 和 IR64是当代的水稻品种，由此可见这两个品种在面对三酮类除草剂时是急需改良的。

（4）分析化学手段验证除草剂代谢物解毒过程
前面已经确认了BBC抗性基因HIS1，然而这一基因如何解除药害的过程是不清楚的，所以作者进一步通过化学性质鉴定和生物合成手段对其进行解析。BBC本身是一种前药，他发挥功能会首先水解为BBC-OH (Fig1. A)，通过BBC-OH对HPPD酶进行调节，最终导致植物的白化。

化学物检测分析，确认BBC-OH这个化学物质是否丢失。
根据分析证明，感性材料Yamadawara中的根部吸收BBC-OH后来转移到叶片中，然而在转基因HIS1抗性品种中，尽管根部存在BBC-OH，但是叶片未检测到，因而表明HIS1基因产物在水稻中将BBC-OH降解了。

构建体外表达体系，检查BBC-OH的分子量等变化。
构建体外无细胞翻译系统（cell-free translation system）得到HIS1蛋白产物，验证对除草剂的灭活作用。高效液相色谱结果表明HIS1产物可以催化BBC-OH产生BBC-OH 代谢物。在HPPD中，BBC-OH和BBC-OH代谢物对HPPD的抑制情况对比，结果表明，后者完全失去抑制HPPD活性的能力，因而实现除草剂的解毒。LC-ESI-MS结果表明BBC-OH 代谢物比BBC-OH 多16分子量，因此猜测是单个氧原子的引入造成的，即羟基化（OH）。

合成模拟BBC-OH结构，确认作用位点。
为了确认羟基化位点，作者模拟BBC-OH结构合成了一个化合物3-乙酰基-BOD，HPLC 和 LC-ESI-MS 分析表明，3-乙酰基-BOD 被 HIS1 转化为羟基化衍生物。核磁共振 (NMR) 显示该衍生物在 C8 位具有羟基，因此被鉴定为 8-OH-3-乙酰基-BOD。 BBC-OH 代谢物在图 4C 中产生了两个峰（峰 1 和 2），8-OH-3-乙酰基-BOD 在图 4D 中表现为部分重叠的峰。

分析合成化合物的结果，同时检测其他几种除草剂下代谢物的变化。
这些结果表明，由于在 BBC-OH 和 3-乙酰基-BOD 的 C8 位形成羟基，至少产生了两种异构体。 BBC-OH 裂解片段（165，峰 3）和峰 1 和峰 2（各为 181）的质荷比 (m/z) 比也表明 HIS1 在 BBC-OH 的相应位置催化羟基化。因此我们得出结论，BBC-OH 在 HIS1 作为 Fe(II)/2OG 依赖性加氧酶催化的反应中的相应位置发生羟基化。HPLC 显示 HIS1 还修饰 TFT、SLT 和 MST 以及 BBC-OH，这与表达 HIS1 的植物的除草剂敏感性测试结果一致。LC-ESI-MS 分析显示 HIS1 从这些 bTH 产生的化合物的分子量都比母体分子的分子量大 16，表明 HIS1 催化 TFT、SLT 和 MST 的羟基化，如同降解 BBC-OH一样。

总结：
本段作者证明BBC-OH是因为由于HIS1基因产物的参与生成BBC-OH代谢物，而这个代谢物是羟基化的BBC-OH，这个代谢物丧失了抑制HPPD酶活性的能力，因此不能产生植物药害，也不能在叶片中检出。

3. 心得体会

（1）本文在定位方面的工作非常简洁巧妙，粗中有细，通过BC1F2和染色体代换系，结合结构域分析，实现快速定位目标基因HIS1，功底扎实。
（2）基因家族分析巧妙寻找OsHSL1基因，并通过转基因实验和表型鉴定确认这个基因存在TFT除草剂的抗性功能，发现与HIS1的协同作用。细小分析见逻辑缜密，从期初HIS1 Tos17突变体中发现TFT植株未受药害，表明可能存在本家族的其他基因响应了这个过程。进而顺水推舟，找到这个OsHSL1。
（3）代谢解毒方面通过HPLC和其他技术进行测定，证明了BBC-OH的羟基化，解释了抗性材料叶片中检测不到BBC-OH的原因。这个证明在一定程度上说服了读者是这样导致植物抗药害的。

我个人而言感觉，本文在Science Report中的发文虽然整体的工作体量并非庞大，然而亮点主要分为以下两个方面：

（1）工作的实际应用价值意义深远，这种价值是可以看得见的，几年内可以实现产业化落到实地的品种改良。
（2）HPPD三酮类除草剂市场份额巨大，潜力巨大，而这个时候的抗性基因和育种的完美结合，更是水稻以及其他相近物种的福音。

有些疑惑的地方：
（1）在鉴定代谢物变化和羟基化位点时使用的是人工合成模拟的，不知道这是否是通用的验证方法，这样合成的物质和BBC-OH是否存在一定的差异性，他们之间是如何实现类比推理的。（可能是化学方面的可以性质相似？）
（2）本文整体上是完整的这样的逻辑故事，有些地方感觉是存在一些技巧的方法，需要作者的强大知识。后期的证明中未从分子生物学实验中证明蛋白之间的互作调控这类的操作，本文是从分析化学方面证明了这一点。
（3）对OsHSL1的基因没有过多的探讨了，当然后面的HPPD受到抑制后造成植物白化，这个过程没有详细解析。实际上，HPPD抑制剂型除草剂，他们的后期抑制途径是明确的，因此作者也就没必要再继续后面的通路探讨了。²

Note：
近等基因系: 将双亲杂交后的材料（玉米等作物），使用其中一个亲本作为轮回亲本，对其进行多代回交，最终获得的群体材料和轮回亲本的背景十分接近，只有一个或者少数几个基因存在差别。

渐渗系：通常指进化过程中物种与外源物种的基因信息交流而成的群体材料或株系。
染色体片段代换系：通常指外源染色体片段把原有染色体片段替换的群体材料或株系。

---

1. HPPD 抑制剂类除草剂的产品研发及市场概况，世界农药，2021. 5. ↩︎

2. https://en.wikipedia.org/wiki/4-hydroxyphenylpyruvate_dioxygenase_inhibitor ↩︎