1 田间水稻微生物组群落随时间与生长变化研究

Root microbiota shift in rice correlates with resident time in the field and developmental stage
概述
In monocots and dicots, roots mainly associate with Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, and Firmicutes.
在单子叶和双子叶植物中，主要相关的菌群：变形菌门, 放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门。
实验方法
水稻种植
两品种水稻：Nipponbare水稻品种：日本晴、IR24
种子消毒：去壳，75%乙醇30s，后三次2.5%次氯酸钠15分钟。dehulled, surface sterilized in 75% ethanol for 30 s and 2.5% sodium hypochlorite three times for 15 min
接种于MS培养基发芽至2周（MS agar media）
fields on Changping farm (116.424E, 40.109N) and Shangzhuang farm (116.206E, 40.122N).
采样处理（446 samples）
对照：相应的地块的非种植土unplanted soil at
day 0 and three unplanted soil samples after 4 weeks
种下前2周：连续区间法successive intervals (0, 1, 2, 3, 5, 7, 10, and 14 days)采样，采样深度0-10cm
之后每周采样：6株Nipponbare；3株IR24，无菌水冲洗掉浮土，50ml离心管里25 mL无菌磷酸盐缓冲盐水180rpm洗三次。根在无菌滤纸上晾干并储存在 −80°C
DNA提取
利用均质器Precellys Evolution 7200rpm 30s均质处理的根和上面仍带有的土
FastDNA SPIN Kit (MP Biomedicals)提取DNA
PicoGreen dsDNA Assay Kit(Life technologies, USA)双链DNA定量试剂盒，后稀释至3.5ng/μl
V5–V7 区测序 799F (Chelius and Triplett, 2001) and 1193R(Lundberg et al., 2012).
自主建库测序：
3平行1加纯水CK，30μl反应体系：3μl模板，0.75UPrimeSTAR HS DNA Polymerase，1× PrimeSTAR Buffer (TaKaRa, Japan), 0.2 mmol L−1 dNTPs, 和10 pmol L−1 正反向加了barcode的引物。
PCR反应条件：预变性98°C 30 s, 25个循环： 98°C for 10 s, 55°C
for 15 s and 72°C for 60 s,最后5 min at 72°C.
CK未出现条带，则将3平行混合，纯化DNA AMPure XP Kit (Beckman Coulter)，Nanodrop (NanoDrop
2000C, Thermo Scientific)检测后稀释至10ng/μl，开始二代测序
一样本3技术平行，进行第一轮8循环扩增，用Illumina-compatible primers引物，后3技术平行混合为一个样本，1.2%琼脂糖电泳，QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA)切胶纯化，双链DNA浓度检测PicoGreen dsDNA Assay Kit (Life technologies)，200ng混样后清洗Agencourt AMPure XP Kit (Beckman Coulter GmbH, USA)，然后建库第二轮测序HiSeq 2500 platform (Illumina Inc., USA).
分析方法
得到OTU表格
双端序列过滤：FastQC
拼接：qiime join_- paired_ends.py
提取barcode：extract_barcodes.py
过滤非16S序列：Greengenes database using PyNAST (align_seqs.py script).
生成OTU表格：USEARCH (-usearch_global and uc2otutab.py scripts).
未匹配序列：75%置信度丢弃，filter_fasta.py
注释：RDP classifier.
OTU分析
丰度与分类：负二项分布的广义线性模型negative binomial generalized linear model。edgeR package44
标准化后建立负二项分布的广义线性模型calcNormFactors function and then used the estimateGLMCommonDisp and estimateGLMTagwiseDisp functions to estimate common and tagwise dispersions for a Negative Binomial Generalized Linear Model
利用glmFit function检测丰度（p＜0.05）
皮尔逊相关系数，由3-6个平行样品平均后得来：Pearson correlation coefficient was calculated by a cor() function using the corrplot package
组间比较：adonis() function in the vegan package
机器学习——随机森林算法：纲水平有最好的判别度：best discriminant performance：使用R中的默认参数：R implementation of the algorithm (R package‘randomForest’, ntree=1,000, using default mtry of p/3 where p is the number of taxa of class).
用rfcv() function in the R package对随机森林算法进行了1000次迭代，迭代5遍，
The minimum cross-validation
error最小交叉验证错误得到47个刚；但用23个纲曲线刚好稳定the number of classes against cross-validation error curve stabilized最后就选了23个纲作为代表marker taxa
结论
时间序列是主要的影响因素。因为两种作物的生长周期很相似，所以没有以作物分类，统计时全部放在一起统计；虽然在PCoA3轴上能明显区分两块地块，但主要还是水稻生长时间成长时间是主要因素；
Pearson correlation coefficient 皮尔森相关系数 two cultivars in two separate fields不同区域两个品种，8——10周微生物趋于稳定
利用Bray-Curtis distance距离。计算了最后一次采样和其他时间采样的Bray-Curtis distance距离后发现，不同区域两个品种差异在随时间减少。说明水稻成熟之前整个根微生物群都相对较小，提示反映了衰老过程。
比较了不同种植区域的同一时间点的两个品种水稻的Bray-Curtis distance距离，对土壤对照也做了相同比较
水稻随时间变化微生物特定类群：首先发现day0和day1微生物群落差异较大，说明微生物定植发生在24h
土壤变化随时间变化较小，但水稻根系微生物随水稻停留时间和发育阶段变化很大
δ 变形菌纲显著增加，而β-变形菌纲，厚壁菌纲和γ-变形菌纲数量急剧减少
所有这些数据显示水稻基因型和地理位置位置影响着根微生物群转移的模式跨越稻田的时间和发展阶段。
随机森林算法建立一个水稻根际微生物与时间关联的模型拥有92.18%的解释度。
讨论
植物在不同阶段可以主动吸收不同的根微生物（For example, Nitrospira丰度5周开始一直很高，和N吸收有关）
本研究与美国土壤微生物一项研究趋势吻合（(Edwards et al., 2018），表明我们的数据反映了趋势的总体趋势水稻生命周期中的水稻根系微生物群动力学。
表明一个微生物根的快速殖民化发生在第一个24小时。
这表明了在根微生物群中发生的移位模式水稻生命周期由宿主基因型和地理位置决定。
SCIENCE CHINA Life Sciences 
https://doi.org/10.1007/s11427-018-9284-4
概念
Pearson correlation coefficient 皮尔森相关系数：是一种线性相关系数。皮尔森相关系数是用来反映两个变量线性相关程度的统计量。相关系数用r表示，其中n为样本量，分别为两个变量的观测值和均值。r描述的是两个变量间线性相关强弱的程度。r的绝对值越大表明相关性越强。

Bray-Curtis distance距离：Bray-Curtis 相异度（Bray-Curtis dissimilarity）是生态学中用来衡量不同样地物种组成差异的测度。由J. Roger Bray and John T. Curtis 提出。其计算基于样本中不同物种组成的数量特征（多度，盖度，重要值等）。