耕作方式对微生物群落的影响

Cropping practices manipulate abundance patterns of root and soil microbiome members paving the way to smart farming

C：普通耕作    O：有机耕作
NT：免耕    RT：少耕    IT：密集耕作
C-IT   C-NT   
O-IT   O-RT
Hartman et al. Microbiome (2018) 6:14
DOI 10.1186/s40168-017-0389-9
概述
实验方法
实验设计
Farming Systems and Tillage (FAST) experiment农业系统和耕作试验：near Zürich, Switzerland (47° 26′ 20″ N 8° 31′ 40″ E)。两次重复：summer2009 &2010
C：普通耕作    O：有机耕作
NT：免耕    RT：少耕    IT：密集耕作
4个样品：
C-IT：普通密集耕作   C-NT：普通免耕 
O-IT：有机密集耕作   O-RT：有机少耕
没有有机免耕（O-NT）因为不符合农业操作规范
样本：根和覆盖植物的土壤
4种不同的耕作方式，每个4个平行，2种样本（根和土壤）。
土样采集时将0-20cm深度的土样采集混合在一起作为一个样。立即-80℃保存，直到DNA提取。
根采集时5个全根系混合在一起。并不区分内生菌和根外菌。
4 cropping systems(C-IT, C-NT, O-IT, O-RT) * 4 replicates * 2 sample types (soil and root)).
土壤理化：pH, organic and total C, total N, and soil texture。pH，有机C总C；有机N总N；土壤性质
样本处理和测序
样本处理：根冻干48h，后球磨机粉碎。300mg土壤和根里提取，试剂盒：NucleoSpin Soil DNA extraction kit (Machery-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Germany)，每个样本提取两次后混合DNA。DNA质量由试剂盒检测Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Eugene,OR, USA)
测序：16S rRNA 引物： 799F and 1193R.（V5-V7）
ITS 引物： fITS7 and ITS4.（ITS2）
测序：MiSeq 2×300
生信分析
得到OTU
PRINSEQ：质控和剪切3`端
FLASH：拼接合并序列
Cutadapt：去冗余，再用PRINSEQ质控
16S：DNA被修剪至同样360bp长度（以切除引物，这种思路是454测序时的思路），再UPARSE方法97%聚类；UCHIME与GOLD database比对去除嵌合体。注释利用SILVA database v119在qiime里用RDP classifier注释。
ITS：DNA被修剪至同样220bp长度，利用UNITE数据库v7去冗余注释。
OTU处理分析
16S：去除OTU中注释到线粒体和叶绿体的chloroplasts
and mitochondria
ITS：植物，原生生物，或界或门未注释的删除
α多样性：稀释曲线：16S：1000到37000；
ITS：1000到48000；步长1000，迭代100次
我们想知道不同样本和耕作方式对种群的影响：随机抽出了一个含有约11000个细菌9000个真菌的样品，在土壤和根际之间用了t检验；之后对样地和耕作模式在observed species richness（observed OTU），在不同门和不同样本之间，做了two way ANOVA检验。
因为地块和种植方式混合，所以未检查地块/种植方式的相互影响。【R package TukeyC】
β多样性：抽平：trimmed means of M” (TMM) method with the BioConductor package 【edgeR】，Bray-Curtis，expressed the normalized counts as relative abundance counts per million (CPM).Counts Per Million类似RPKM，edgeR可从count计算CPM或者RPKM。
排序分析Ordination analyses：R package 【phyloseq】http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/phyloseq.html
置换方差分析统计组间差异性：permutational analysis of variance (PERMANOVA)：adonis in the 【vegan】 package
中间的参数有：至少存在于4个样品中的至少为2条以上的OTU，抽平用的是TMM method and CPM.Statistical significance of the CAP（constrained analysis of principal coordinates 主坐标的约束分析）was assessed using the permutest function in the 【vegan】package with 104 permutations
耕作方式对社区不同的影响：permutational analysis of variance (PERMANOVA)and permutational analysis of multivariate dispersions (BETADISP) using the functions adonis and betadisp,respectively, in the vegan package with 104 permutations.
不同的耕作方式评估：pairwise.perm.manova from the package RVAideMemoire
耕作方式敏感OTU：R package 【indicspecies】：calculate the point-biserial correlation coefficient (r) of an OTU’s positive association to one or a combination of cropping systems
之后在不同的耕作方式中测试了不同OTU丰度using likelihood ratio tests(LRT) with the R package edgeR
Bipartite networks二分网络：R package 【igraph】
Co-occurrence networks共线网络：【igraph】greedy optimization of modularity algorithm [93] as implemented in igraph
结果
土壤和根际微生物：2972 bacterial, 3 archaeal, and 1975 fungal operational taxonomic units (OTUs) across all samples
土壤和根际微生物有明显的区分：fig1火山图
注释组内信息：figS3：柱状图
β多样性：PCoA和PERMANOVA 用Bray-Curtis法
PERMANOVA分析：PERMANOVA与ANOSIM（Analysis of similarities）等方法的目的类似，即比较样品组间的差异显著性。例：对多组数据进行聚类分析后得到2个大类，但是想知道这2个大类之间的差异是否显著，即可用上述方法。
ANOSIM比较的是组内或组间距离的平均值；对于样本量大小变化很敏感，适用于样本在欧式平面（Euclidean space）中单个数据变化有重要意义的情况；另，ANOSIM对异质性数据（方差不齐）很敏感，方差不等的情况不宜使用。
PERMANOVA比ANOSIM更强大，比较的是各组重心之间的差异；对样本数N以及方差的齐次性要求不高，推荐使用。
样本类型Sample type和耕作技术crop.system为主要影响
α多样性：土壤具有更高的物种丰度和多样性
稀释曲线：11000个细菌；9000个真菌OTU，O-IT细菌真菌丰度最高
T test & ANOVA test
耕作方式对土壤微生物群落的影响
canonical analysis of principal coordinates (CAP)分析；PERMANOVA计算显著性；BETADISP计算离散程度
细菌由耕作方式产生差异同时，管理类型也是影响因素；
真菌主要由耕作方式影响
确定耕作敏感OTU
二分网络bipartite network
并未发现核心菌群，互相之间共享相关菌群
耕作方式菌群的共线性网络
首先构建了细菌、真菌各自的共线性网络。同时将S6中的共有OTU标注在共线性网络中。发现他们都根据耕作强度或耕作方式都聚在一起。
接下来构建了细菌真菌共网络

分析流程