Dragoš-2018-Evolution of exploitative interactions during diversification in Bacillus.md

Evolution of exploitative interactions during diversification in Bacillus subtilis biofilms

Dragoš, A., Lakshmanan, N., Martin, M., Horváth, B., Maróti, G., Falcón García, C., Lieleg, O., & Kovács, Á. T. (2018). Evolution of exploitative interactions during diversification in Bacillus subtilis biofilms. FEMS microbiology ecology, 94(1), fix155.

摘要

微生物膜是一种结构紧密，种类多样的如同社交互动场所的结构。革兰氏阴性菌模型揭示了在结构化环境（如生物膜）进化过程中，同基因群落逐渐分化为不同表型和基因型的群落。这些不同的群落可以定殖于不同的生物膜生态位，并发展出新的相互作用类型，这些相互作用极大地影响了群落的生产力。在本篇文章中，我们探索了可以产生芽孢的革兰氏阳性菌Bacillus subtilis形成生物膜的多样性。我们研究了与其他物种类似的B. subtilis分化出的不同菌落变体。这些变体在生物膜形成能力和生物膜相关基因的表达上有明显的差异。除此之外，使用一种定量的方法，我们揭示了这些不同菌落进化类型在了表面复杂度和疏水性上有着显著差异。有趣的是，一种形态学类型完全失去了独立生物膜形成能力，并进化出了与其他形态学类型相互作用促进生物膜形成的能力。基因组对比支持了形态学类型之间主要表型变化可以被细小的基因变化所驱动。我们的研究揭示了在生物膜的分化进化过程中，微生物之间积极互补和相互利用的过程。

引言

• 生态位的互补效应可以导致混合的环境型产量提升。
• 之前关于生物膜的研究已经证明，不同菌落形态的变体很容易出现；这些不同的变体具有不同的生物膜形成能力；这些差异导致新的空间排列，可以降低生态位的重叠，并可以提升群落的生产能力。
• 缺乏胞外多糖或者TasA会一直生物膜的形成，但是这些基质化合物可以在生产者和非生产者之间共享。

材料和方法

菌株和培养条件

• Bacillus subtilis NCBI 3610, DK1042 strain
• Lysogeny broth (LB)培养基
  • 10 g/L tryptone
  • 5 g/L yeast extract
  • 5 g/L NaCl
  • 菌株保存
• MSgg medium
  • 生物膜诱导

实验条件下的进化和产量分析

• 于24孔板，MSgg培养基中30°C培养48小时，6个重复
• 成熟的生物膜使用接种环挑出，转移至2 mL 含有1 mL 0.9% NaCL 和100 μL 石英砂的EP管中，漩涡震荡60 s，将生物膜结构分散为单细胞和小团粒，通过漩涡震荡避免超声污染风险。
• 得到的菌悬液测定CFU，并取部分保存于-80°C稀释100倍后重新接种。

菌落形态分析

• LB和MSgg培养基，1.5%琼脂
• 2 μL过夜培养液接种于平板，液滴干燥后关闭平板
• 30 °C培养48 h

表面特征分析

• NanoFocus μsurf light profilometer
• 放大20 x，覆盖800 * 722 μm区域
• Sdr = 0表示表面平整

疏水性测试

• 10 μL水滴在菌落中心
• 水平拍照
• 接触角使用ImageJ中‘drop snake’插件分析

消耗物质补充分析

• 使用微孔滤膜(0.2 μm)获取ancestor菌株上清液(SN)
• MSgg + ancestor SN
• MSgg + Smooth SN 对照组

结果

Evolution of pellicle biofilms of B. subtilis involves rapid diversification into four distinct morphotypes

• 除了部分例外情况(e.g. #35)，生物膜群落CFU/mL在整个进化实验中逐步提升(Fig. 1A)
• 通过CFU分析发现在6个类群分化为4个不同的菌落类型
  • Wrinkly
    菌落中心表现出更明显的复杂度
  • Rough
    类似ancestor
  • Spreader
    菌落扩张性更为明显
  • Smooth
    表面平滑
• 4种菌落类型在不同的类群中含量有一定差异(Fig. 1C)
• 通过对于冻存样品的分析，研究不同生物膜类型的进化历史(Fig. 1D)
  • 5th 转移的菌落与Rough相似，且ancestor于Rough非常相似
  • Wrinkly在10th 开始出现，并切持续出现到35th
  • Spreader和Smooth出现在19th
  • Spreader出现后相对丰度稳定
  • Smooth持续波动，24th接近于0，在后面的时间点恢复至30%以上
  • Smooht的比例和生物量变化相反

Evolved morphotypes develop colonies with distinct surface complexity and hydrophobicity

• 虽然结果收到培养基类型的影响，但部分明显的形态学区别与培养基无关
  • Smooth在所有培养基上均没有表面复杂度
  • 在MSgg上，Ancestor和Rough的表面复杂度比Wrinkly和Spreader高4倍
  • 在LB上，所有变种的表面复杂度均低于Ancestor，Wrinkly和Rough具有较高的Sdr值
• 表面复杂度可能与疏水性有关
  • Smooth缺乏普遍的生物膜疏水性，并且在LB和MSgg培养基上表现出完全的亲水性(Fig. 2A and C)
  • Rough和ancestor在MSgg培养基上表现出疏水性，而在LB上没有
  • Spreader通常是亲水的，而边缘表现出高疏水性

Morphotypes display distinct levels of matrix gene expression

• 不同的菌落表面复杂度和和疏水性表现可能与不同的胞外基质(extracellular matrix, ECM)生产水平相关
• P_tapA-gfp和P_eps-gfp 基因被转入四种形态学类型和ancestor菌株，并测定基质相关基因表达量(Fig. 3A)
• P_tapA-gfp和P_eps-gfp基因的表达量在Smooth中最低，在Spreader中表达，在Rough和Wrinkly中高表达
• Smooth在单独培养时无法形成生物膜(Fig. 3B)
• Wrinkly的生物膜和ancestor相似，Rough和Spreader相比ancestor褶皱更少，表面相对光泽
• 4种混合培养的生物膜表现出类似ancestor的褶皱
• 加入ancestor的培养基生清液后，Smooth可以生成生物膜，认为Smooth可以利用其他菌株分泌的ECM形成生物膜

Non-matrix producing morphotype exploits matrix-producing variants

• 通过对比单菌生物膜和培养形成的生物膜，形态学类型在个体和分组表现中对多样性的影响。除此之外，还研究了混合培养种每一种形态学类型出现几率
• 除Smooth外，其余菌株相比ancestor均有明显的提升。Rough和Spreader的产量高2-3倍，Wrinkly的产量最高(Fig. 3D)
• 接种策略
  1. 4种形态学类型按照1:1:1:1接种
  2. 按照进化后生物膜中的比例(Wrinkly 9%, Rough 53%, Spreader 6%, and Smooth 32%)
• 单菌的产量均高于混合混合培养
• 接种策略（单菌比例）影响产量，
• 无论初始接种量如何，生物膜中最终的群落组成比例比较相似。假设稳定的群落结构被生物膜中特定的形态学类型排列模式所决定
• 荧光标记下的配对实验用以分析形态学类型对于生物膜的贡献是否为随机性(Fig. 4)
  • Smooth大多分布在底层，可能附着于基质生产菌株
  • 尽管相对丰度相比Rough较低，Spread和Wrinkly仍然出现在生物膜的整个横断面
  • Rough，Wrinkly，Spreader共享相同的生态位，Smooth位于更深层的位置，位于生物膜的中间区域

Diversification involves mutations related to biofilm regulation, motility and anaerobic respiration pathways

• 测序样品
  -群落1中4种不同的形态学类型以及其他群落中随机选取的6歌菌株
  • 2A，2B，3C菌株表现为Wrinkly
  • 1B，4B，6C表现为Rough
• 测序共发现超过400个突变，其中386个突变为重叠突变，不进行后续分析，因为这些突变可能是为了适应实验室环境或特定培养基所产生的普遍突变
• 共检测的58个不重叠的突变
• 部分突变在不同形态学类型的非编码区和rRNA出现，证明他们出现在早期的进化过程中
• 部分NC突变仅出现在Smooth和Spreader中，可能代表着这些区域具有某些未知的调控功能
• 在全部的Rough和Wrinkly菌株中均有大量的HemAT，可能在生物膜的形成中起到重要作用
• Spreader和Smooth菌株中与适应底层低氧环境相关的rex基因大量表达
• 通过研究rex和guaA缺失的菌株的生物膜生成和菌落形态，均没有表现出与Spreader和Smooth相似的表型。认为重新产生新的性的形态学类型至少2种不同的SNP。
• Smooth可能是Spreader的先祖形式
• Wrinkly可能源于Rough，因其出现在Rough之后且包含与Rough重叠的突变和SNP

讨论

-最近的研究表明，菌落微观结构的微小差别可能导致菌落疏水性的差别，最终导致对抗菌物质的抵抗能力。

• 复杂的表面结构并不足以维持B. subtilis菌落的疏水性。
• 在一定程度上，表面复杂度和疏水性被基质相关基因表达水平相关，但这种相关性并不十分明确。
• 复杂的菌落结构可能被死亡细胞所影响，进化的形态学类型中细胞生存能力的改变具有平衡EPS生产效率提升的作用。
• 进化类型(Rough, Wrinkly, Spreader)生物膜产量有所提升，但会失去一些在ancestor(Wrinkly, Spreader)中存在的性状。可能数量和质量不可兼得。
• 避免生态位竞争，可以为自身带来有利影响。
• 实验室培养的B. subtilis通常会出现驯化问题(domestication problem，可能指“菌种退化”)，而不生成生物膜的Smooth在生物膜选择培养基中依然可以进化，我们认为这类菌株并不是出现了退化，而是进化过程中的一部分。