Chlorophyllase (PsCLH1) and light-harvesting chlorophyll a/b binding protein 1 (PsLhcb1) and PsLhcb5 maintain petal greenness in Paeonia suffruticosa ‘Lv Mu Yin Yu’
叶绿素酶（PsCLH1）和捕光叶绿素a/b结合蛋白1（PsLhcb1）和PsLhcb5共同维持绿牡丹“绿幕隐玉”的花瓣绿色
摘要
前言：绿花在自然植物中并不是一种适应性性状，因为传粉者很难区分与叶子区分，但在园艺中却很有价值。绿色花瓣形成的分子机制尚不清楚。牡丹（Paeonia suffruticosa）是全球种植的观赏植物，被认为是中国的 ‘’花之王‘’ 。绿色花瓣的绿幕隐玉（LMYY）可以作为了解花瓣特异性叶绿素（Chl）积累和颜色形成的代表性模型。
目的：鉴定Chl代谢相关关键基因，了解花瓣颜色变化的分子机制。
方法：用色度分光光度计分析5个发育阶段的花瓣颜色参数，考察Chl和花青素的积累规律。基于比较转录组，鉴定差异表达基因，其中3个基因通过烟草植株的过表达或 ‘LMYY’ 花瓣的沉默进行了功能表征。
结果：在花的发育和开花过程中，花的颜色由绿色变为淡粉色，与Chl和花青素水平一致。Chl水平与花瓣表皮细胞条纹密度的变化规律相似。通过对花瓣三个关键发育阶段的比较转录组分析，鉴定了负责Chl和花青素代谢的差异基因。关键叶绿素酶（PsCLH1）和捕光叶绿素a/b结合蛋白1 （PsLhcb1）和PsLhcb5影响 ‘LMYY’ 花瓣Chl积累和绿度。
结论：PsLh1、PsLhcb1和PsLhcb5在Chl积累和花瓣绿度维持中起关键作用。从绿色到淡粉色的花色变化受Chl降解和花青素生物合成的稳态调节。该研究为绿色花瓣的分子机制和种质资源创新提供了新的思路。
引言
花色是贯穿植物物种进化的一种适应性表型特征。在园艺领域，它代表了观赏植物的一种品质性状，对提高商业价值和产量至关重要 [1]。绿色花由于其独特的特点和稀缺性，受到广泛欢迎，具有很大的商业价值。由于传粉昆虫和花之间的相互作用，绿色并不是天然植物的最佳性状，因此在植物进化、适应和育种方面，这些植物一直是相当重要的科学研究课题。种植绿色花卉已成为育种者的目标，比如在全球范围内作为瓶花和花园装饰品的菊花和康乃馨 [2-4]。对调控绿色花花色形成的分子机制研究仅在有限的几种物种中进行，包括百合 [5]、铁皮石斛 [6]和菊花 [4]。缺乏确定的分子机制限制了对绿色花的培育，无法满足公众的需求。花朵的颜色由花瓣中积累的色素及其各自的浓度决定。绿色花瓣的形成是由于叶绿素（Chl）的生物合成和积累。花瓣来源于叶子 [7]，绿色的花瓣可能是光合作用的结果。因此，与绿色花瓣形成相关的基因也与我们对Chl生物合成和代谢的理解相关，特别是那些与叶片相比下的差异表达基因。对花瓣绿色化和其他典型颜色（如粉红色）的研究提供了一个理解Chl和其他色素之间平衡的理想模型。因此，对颜色形成调控机制的研究对解析绿色花卉形成的机制是必要的，特别是在有较长的寿命和理想的特性的木本观赏植物中。
牡丹（Paeonia suffruticosa Andrew）是全球知名的观赏木本植物，作为园林植物、盆花和瓶花被广泛种植 [8]。牡丹作为“花中之王”在中国已有2000多年的栽培历史，颜色多样，有粉、红、紫、白等，其中绿色的花较为罕见 [9]。因此，一些绿色牡丹品种，例如“绿幕隐玉”、“春柳”、“豆绿”因其美观和稀有性而具有更高的商业价值。牡丹花发育分为5个阶段，分别称为S1（紧密花蕾阶段）、S2（膨胀花蕾阶段）、S3（初开阶段）、S4（杯状盛开阶段）和S5（盛开阶段）[10]。然而，这些绿色品种的花卉仅有绿色的花蕾，在开花期间花瓣会从绿色变为白色或粉红色。牡丹花期保持绿色的机制尚不清楚。花瓣色素分为四类：类黄酮、Chl、类胡萝卜素和甜菜素 [11]。Chl降解和花青素生物合成之间的平衡控制着植物的着色，如荔枝的果实、观赏羽衣甘蓝的叶子和柳树的树皮 [12-14]。由于缺乏典型的模型植物来研究从绿色过渡到其他颜色的过程，目前对花瓣颜色变化的分子机制的研究还相对有限 [15]。为了探索叶绿素与其他色素之间平衡的分子机制，必须使用更多植物物种进行研究。
Chl是植物绿色花朵所必需的 [16]，存在于开花植物花瓣发育早期，在开花过程中逐渐降低 [6]；因此，抑制Chl的降解是一个重大的挑战。Chl代谢途径包括三个步骤：1）Chl a的合成；2）Chl a与b的相互转化（Chl循环）；3）Chl a的降解 [17]。叶绿素酶（CLH）作为一种酯酶，能够催化叶绿素（Chl）从类囊体锚定的疏水性植酸链上断裂，产生叶绿素酯（Chlide），包括从叶绿素a/b到叶绿素酯a/b的转化。CLH被认为是叶绿素降解过程中的限速酶 [18]。叶绿素a通过去镁螯合酶STAY-GREEN（SGR）的作用，被降解为脱镁叶绿素a（Phein a），随后Phein a在脱植基酶（PPH）的作用下被脱乙酰化为脱镁叶绿酸a（Pheide a）。同时，叶绿素酯a（Chlide a）也可以直接通过类似SGR的酶（SGRL）去螯合为Pheide a。最终，脱镁叶绿酸a氧气酶（PAO）打开四吡咯环，产生线性形式以便于后续降解途径 [19,20]。Chl降解在一些植物的花瓣中已有研究，包括百合属物种 [5] 和矮牵牛（Petunia hybrida）[2]。与Chl降解相比，质体中捕光Chl a/b结合（Lhc）蛋白对维持绿色很重要，与光系统（PS）Ⅰ和Ⅱ相关，分别命名为Lhca（或LHCⅠ）和Lhcb（或LHCⅡ）[21]。它们还参与发育过程，如种子萌发和萌发后 [22]，以及非生物胁迫耐受 [23-26]。然而，抑制叶绿素降解以保持牡丹花瓣绿色色泽的机制尚不清楚。
本研究以具有代表性的牡丹绿花品种“LMYY”为研究对象，以确定花瓣褪绿的分子机制。首先测定了5个发育阶段的花瓣颜色参数，然后研究了Chl和花青素的积累模式。基于比较转录组，在体内对关键差异表达基因（DEGs）进行了功能表征。
材料和方法
植物材料
绿色花朵的牡丹样本 'LMYY' 种植于中国青岛农业大学（青岛，中国）的实验农场，位于北纬36°19’4’’，东经120°23’11’’，海拔37米，2022年最高气温、最低气温和平均相对湿度分别为33.74°C、-6.86°C和74.93%（https://www.weatherspark.com/）。五个典型的花发育阶段如下[10]：S1（紧密花蕾阶段）、S2（膨胀花蕾阶段）、S3（初开阶段）、S4（杯状盛开阶段）和S5（盛开阶段）。采集的样品储存在-80°C下以供进一步分析。烟草（Nicotiana tabacum cv. Nc89）的种植方法如前所述 [27]。
花颜色参数测定
国际照明委员会（CIE）在1976年推荐了两种近似均匀的颜色空间和色差公式（CIELAB空间和CIELUV）[28]。CIELAB空间（L* a* b*）已被广泛用于描述果实、叶子和花朵的颜色。L * 的值范围从黑色（0）到白色（100），a *的值范围从红色（正值）到绿色（负值），b *的值范围从黄色（正值）到蓝色（负值）。CIEL *a *b *颜色系统如前所述[29]，使用色度分光光度计CR-400进行（柯尼卡美能达，日本）。对单独五个重复学样本的花瓣腹面中部进行测量。选取平均值进行分析。
Chl和花青素水平测定
总Chl、Chl a和Chl b水平测定方式如前所述[30]。具体如下，花瓣在4°C，黑暗中用95%乙醇提取48小时。然后用紫外光度计在645和663 nm处对提取液进行评价。Chl浓度（μg/g FW）计算如下[V为萃取液体积（mL）， A为吸光度，m为花瓣FW （g）]:
总花青素含量测定方法如前所述[10]，花瓣在4℃的0.1 mol/L HCl-CH3OH溶液（1：99，1 mol/L HCl：1 mol/L CH3OH， v/v）中浸泡24 h。提取液用紫外光度计在530、620和650 nm处测定。总花青素含量的测定方法如下[V为提取液体积（mL）， A为吸光度，m为花瓣FW （g）， e为花青素的摩尔消光系数，为4.62 × 106]:
表皮细胞观察
将每个花发育阶段的花瓣切成小正方形（大小约为 5 m㎡），固定在FAA溶液中48小时，然后使用50、70、80、90和100%的乙醇梯度系列脱水，各5分钟。最后用醋酸异丙酯代替无水乙醇，将样品在Emitech K850临界点干燥器中干燥，随后使用JFC-1600离子溅射仪涂覆铂金，在JEOL 7500F扫描电子显微镜（美国皮博迪）下进行检查 [30]。
转录组测序和DEG分析
对三个关键发育阶段（S1, S3和S5）的花瓣进行转录组测序，数据是通过北京生物标志物技术公司（中国北京）使用Illumina HiSeq 2000平台的合成测序（SBS）技术获得的。去除接头序列和低质量读长后，获得高质量的干净数据进行序列组装。
采用Ebseq进行差异表达分析，鉴定比较组间的deg[31]。筛选标准为FDR（错误发现率）< 0.001和|fold change| ≥ 2。使用topGO R软件包分别基于Kolmogorov-Smirnov测试和KOBAS软件对DEGs进行GO和KEGG途径富集分析。在富集分析的基础上，进一步筛选了参与Chl降解和花青素生物合成的deg。
定量RT-PCR（qRT-PCR）分析
采用SYBR qPCR Master Mix （Vazyme, China）进行qRT-PCR分析 [32]。采用PsTubulin （PsTUB）作为内参。引物如表S1所示。
pslhh1、PsLhcb1和pslhcb5过表达烟草植株
将PsCLH1、PsLhcb1和PsLhcb5的编码序列克隆到pSuper1300中 [33]。耐潮霉素B的植株转移到土壤中，并在盆中栽培，T2转基因株系用于进一步分析。引物列在表S1中。
病毒诱导的基因沉默（VIGS）
VIGS实验参照先前方法[34]。利用PsCLH1（379 bp）、PsLhcb1（306 bp）和PsLhcb5（339 bp）基因特异性片段构建pTRV-PsCLH1、pTRV-PsLhcb1和pTRV-PsLhcb5载体，并将其转化为农杆菌GV3101菌株。将转化后的GV3101细胞重悬于浸润缓冲液（10 mM MgCl2, 200 mM acetosyringone, and 10 mM 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid, pH 5.6）和分别含有等体积pTRV1 + pTRV2- psclh /PsLhcb1/ PsLhcb5或pTRV1 + pTRV2的GV3101培养物混合物中作为阴性对照。将花瓣真空浸润，在8℃培养箱中黑暗培养3天，然后在23℃下光照14小时/黑暗10小时的光周期下培养8天。培养结束后，对花瓣进行qRT-PCR分析和Chl含量鉴定。所有用于VIGS的引物如表S1所示。
牡丹基因组Lhcs的鉴定及基因结构分析
利用'LMYY'的转录组和牡丹基因组数据库（国家基因库核酸序列归档系统（CNSA）FTP公开服务 - CNGB Sequence Archive (CNSA) FTP public service）中的Lhcs序列，通过TBtools双向BLAST比对，鉴定可能的成员[35]。
在NCBI CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）上确定保守结构域后，使用TBtools对PoLhcs进行染色体位置定位和结构分析。
PoLhcs的系统发育分析及保守基序预测
系统发育分析如前所述 [36]。分别从TAIR（TAIR - Arabidopsis）和苹果基因组数据库（GDR）中获取拟南芥（A. thaliana）和苹果（Malus domestica）Lhcs的氨基酸序列为参考。利用MEGA X软件和iTOL（iTOL: Interactive Tree Of Life）基于p-distance模型对23个PoLhcs、21个Atlhcs和27个Mdlhcs构建了Neighbor-Joining系统发育树。分析包括71个氨基酸序列的两两缺失。
PoLhcs氨基酸序列提交给MEME（MEME - Submission form）进行基序分析，基序数量最大值设置为10，并通过TBtools可视化。
共表达网络和启动子分析
通过string数据库（https://www.string-db.org）分析了共表达基因及其功能，并使用Cytoscape和OmicShare工具（OmicShare 基迪奥生物信息云平台）进行了可视化。顺式元件的查询是通过PlantCARE（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）进行的，并用TBtools进行了可视化。
统计分析
使用GraphPad Prism（10.0版本）进行统计分析。采用双尾Student’s t检验和单因素方差分析多重比较检验分析实验数据，P < 0.05、0.01或0.001认为差异显著。
结果
花瓣中Chl积累的变化导致了‘LMYY’花在开花期间的褪绿
牡丹' LMYY '品种是一种受欢迎的绿色系品种。其花发育过程可分为5个阶段：S1，花瓣呈现黄绿色的紧密花蕾阶段；S2：花瓣呈淡绿色的膨胀花蕾阶段；S3：花瓣呈深绿色，并开始从花瓣基部褪绿的初开阶段；S4：花瓣逐渐褪绿变为淡粉色的杯状盛开阶段；S5：花瓣是淡粉色的盛开阶段（图1a）。对颜色进行评价，L *值从97.54 （S1）下降到94.21（S3），再上升到106.58（S4）和107.61 （S5）。a *值为负值，从-6.01（S1）减小到-11.12（S3），从1.25（S4）增大到4.31（S5）； b *值从23.30（S1）增大到29.86（S3），然后减小到14.69（S4），最后下降到最小为10.43（S5）。上述参数的变化与开花过程中花瓣的褪绿情况一致（图1b）。
Chl是决定花瓣绿色的主要色素。为了进一步分析“LMYY”花瓣在开花期间的褪绿规律，测定了Chl水平。Chl a、Chl b和总Chl含量的变化规律相似，从S1到S2先下降，然后迅速增加，在S3达到最大值，分别为115.20（Chl a）、57.96（Chl b）和173.16（总Chl）μg/g FW。S3后，浓度下降，在S5达到最小值，分别为6.37（Chl a）、10.43（Chl b）和16.80（总Chl）μg/g FW（图1c）。我们发现总花青素含量很低，但在花发育和开花期间逐渐增加（S1：0.49，S2：0.56，S3：0.60和S4：1.53 μg/g FW），在S5达到最大值1.89 μg/g FW（图1c），与花瓣颜色一致。
图1。5个发育阶段牡丹‘LMYY’品系花瓣颜色参数、Chl和花青素积累规律。a）5个发育阶段花瓣表型，标尺 = 1 cm。b - c）CIEL*a*b*颜色参数，以及5个阶段Chl和花青素的含量。数值以三个生物重复的平均值±SD表示。单因素方差分析采用Tukey‘s多重比较检验（P < 0.05），各柱上方不同字母表示差异显著（P < 0.05)。d)花瓣中部近轴表皮细胞分5期，黄线为细胞边界，标尺 = 10 μm。
开花期间褪绿的花瓣中观察到表皮细胞的差异
人类眼睛对颜色的感知取决于花瓣表皮细胞不同形状的光反射。本研究比较了花发育和开花过程中5个不同发育阶段的表皮细胞形态。在近轴表皮细胞中发现了最显著的差异（图1d）。表皮细胞条纹堆积的变化与Chl含量有关。在S3阶段，Chl含量最高时，花瓣表皮细胞排列最密，这与S5阶段叶绿素含量最低时的情况相反。值得注意的是，在S4阶段，观察到具有绿色和淡粉色的花瓣中有两种表皮细胞，它们具有不同的条纹排。值得注意的是，在S4阶段，观察到具有绿色和淡粉色的花瓣中有两种表皮细胞，它们具有不同的条纹排列模式。表皮细胞形状的差异有助于理解花瓣颜色的变化。
花瓣转录组分析和与Chl降解相关的独特基因的鉴定
结合花瓣中Chl含量和表皮细胞形状的变化，对花瓣发育的3个关键阶段（S1、S3和S5）进行转录组分析，确定与Chl降解相关的候选基因。共获得32.02 Gb 干净读取, Q30值为94.48 ~ 94.78%（平均为94.60%），GC含量为45.01 ~ 46.87%（平均为45.73%）（表S2）。共获得51,535个unigenes, N50为1,443 bp。
分析每两个发育阶段（S1与S3、S3与S5和S1与S5）之间的差异基因。在三个对照组中共检测到4,643个上调基因和4,595个下调基因，其中S1与S3、S3与S5和S1与S5分别为3,037个（1,419个上调，1,618个下调）、2,996个（1,652个上调，1,344个下调）和3,205个（1,572个上调，1,633个下调）基因（图S1）。对3,754个上调差异基因和4,412个下调差异基因进行GO富集分析，最丰富的差异表达基因（DEGs）分别富集在代谢过程（生物学过程）、细胞组分（细胞组分）和结合（分子功能）中（图S2）。在 S1 与 S3 以及 S3 与 S5 的比较中，差异表达基因富集在光合作用-天线蛋白和光合作用中（图 S3），这表明在花朵发育和开花过程中光合作用存在一些差异。此外，两组差异基因集都富含花青素和类黄酮的生物合成基因，这表明花青素和类黄酮生物合成发生在开花过程中。
Chl的降解是花瓣褪绿的关键。为了进一步探索从S3到S5期间花朵开放过程中叶绿素降解的机制，分析了包括叶绿素酸酯氧化酶（CAO）、非黄化1（NYC1）、叶绿素合成酶（CS）、叶绿素降解酶（CLH）、7-羟甲基叶绿素a还原酶（HCAR）、绿色保持蛋白（SGR）、SGR样蛋白（SGRL）、脱镁叶绿素酶（PPH）、原叶绿素酸酯还原酶（PAO）和红色叶绿素降解还原酶（RCCR）等核心基因的表达模式（图2和表S3）。研究发现，CAO（c41099.graph_c0）、CS（c75307.graph_c0）、CLH（c64639.graph_c0, c67061.graph_c0, c51249.graph_c0）、HCAR（c68087.graph_c0）、SGRL（c34799.graph_c0）和RCCR（c47317.graph_c0）等基因表达下调，而NYC1（c75070.graph_c0）和SGR（c61812.graph_c0）表达上调。两种PPH（c74007.graph_c0 and c69857.graph_c0)）基因表达下调，而其他PPH（c59052.graph_c0 and c55729.graph_c0）基因表达上调。此外，两种PAO（c67358.graph_c0 and c71106.graph_c0）基因表达下调，但只有一个PAO（c73597.graph_c0）基因表达上调。CLH是叶绿素降解的初始和限速酶 [18].，其中c51249.graph_c0（PsCLH1）在S3到S5期间的变化最为显著，表明它可能在花瓣中叶绿素降解中发挥重要作用。通过qRT-PCR评估了PsCLH1的表达模式，结果与RNA-seq结果相似。因此，在进一步的实验中重点关注了c51249.graph_c0（PsCLH1）。
图2。牡丹 ' LMYY '花瓣三个发育阶段参与Chl降解途径的基因转录组图谱推测。基因左侧的圆圈代表了从S3到S5阶段的log2倍数变化值，而基因右侧的圆角矩形代表了log2(FPKM+1)值。其中，Chl代表叶绿素，Phein代表脱镁叶绿素，Pheide代表叶绿素酸酯，Chlide代表叶绿素酸酯，SGR代表脱镁叶绿素酶STAY-GREEN，PPH代表脱镁叶绿素酶，PAO代表叶绿素酸酯a氧化酶，CLH代表叶绿素酶，CAO代表叶绿素酸酯氧化酶，NYC1代表非黄色化1，CS代表叶绿素合成酶，HCAR代表7-羟甲基叶绿素a还原酶，RCCR代表红色叶绿素降解还原酶。
在牡丹'LMYY'花瓣的开花过程中，花青素含量增加（图1c）。在花青素生物合成途径中，丙酮酸辅酶A和4-香豆酰辅酶A通过查尔酮合酶（CHS）缩合生成查尔酮，这些查尔酮通过查尔酮异构酶（CHI）、黄酮醇3-羟化酶（F3H）、黄酮类30-羟化酶（F30H）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和花青素合酶（ANS）的作用依次转化为花青素 [37]。为了进一步研究开放过程中花青素代谢机制，分析了CHS、CHI、F3H、F30H、黄酮醇合酶（FLS）、DFR和ANS的表达模式（图3和表S4）。F3H（c27200.graph_c0）的表达水平从S1到S5增加，与花青素积累一致。然而，大多数基因，包括CHI（c61810.graph_c0、c35230.graph_c0和c69025.graph_c0）、FLS/F3H（c69095.graph_c0）、F30H（c55772.graph_c0）和DFR（c74629.graph_c2）从S1到S3上调，在S3达到峰值，并在开花过程中（S3到S5）下调，这表明S3是花瓣颜色从绿色变为淡粉色的关键点。
图3。牡丹 ' LMYY '花瓣三个发育阶段花青素合成途径的基因转录组图谱推测。基因左侧的圆圈代表从S3到S5的log2倍数变化值，而基因右侧的圆角矩形代表log2(FPKM+1)值。CHS代表查尔酮合酶，CHI代表查尔酮异构酶，F3H代表黄酮醇3-羟化酶，F30H代表黄酮类30-羟化酶，DFR代表二氢黄酮醇4-还原酶，ANS代表花青素合酶，FLS代表黄酮醇合酶。
PsCLH1调控Chl积累，促进' LMYY '花瓣褪绿
为了进一步确定PsCLH1在体内的功能，我们在烟草中异位过表达PsCLH1，并选择了3个PsCLH1高表达的转基因株系（OE-1、OE-2和OE-23）进行进一步的实验。野生型（WT）植株的叶片比PsCLH1-OE植株更绿（图4a-d），这与WT系和PsCLH1-OE系叶片Chl含量一致（图4e-g）。PsCLH1-OE系与WT植株在生长状态上存在显著差异。PsCLH1-OE株系的株高、叶片数、冠宽、单株果数、单果重均较WT株系降低（图S5），说明WT株系的生长活力强于PsCLH1-OE株系。
为了验证其在调节Chl含量中的作用，我们使用VIGS技术在' LMYY '花瓣中沉默了PsCLH1。PsCLH1沉默株的花瓣比TRV对照更绿（图5a）， PsCLH1在沉默株中的表达量比TRV对照显著降低了37.62%（图5b）。PsCLH1沉默系的L *和a * 值（L *76.74, a * -20.56）低于TRV对照（L *87.60, a *-14.71）， b *值低于TRV对照（a *-14.71），而b *值与L *和a *值呈相反趋势（图5c），与表型结果一致（图5a）。与TRV对照（98.50 μg/g FW）比，PsCLH1沉默花瓣的总Chl含量（157.60 μg/g FW）显著增加（图5d）。上述结果表明，PsCLH1降低了‘LMYY’花瓣的Chl含量，促进了‘LMYY’花瓣的褪绿。
图4。过表达PsCLH1、PsLhcb1和PsLhcb5影响了烟草叶片中ChI的积累。a）野生型（WT）植物和过表达（OE）系的表型，比例尺 = 1厘米。b-d）野生型和过表达叶片的CIEL * a * b *颜色参数。e-g)野生型和过表达叶片中的ChI水平。值表示三个生物学重复的平均值 ± 标准差。星号表示与野生型对照相比有显著差异的值（ * P<0.05，* P<0.01，* * * P<0.001，双尾student’s t检验)。
图5。沉默PsCLH1、PsLhcb1和PsLhcb5影响了牡丹（'LMYY'）花瓣中ChI的积累。a)沉默PsCLH1、PsLhcb1和PsLhcb5改变了花瓣的颜色。浸润10天后拍摄TRV对照花瓣和沉默花瓣的图像。b）TRV对照和沉默花瓣中PsCLH1、PsLhcb1和PsLhcb5的qRT-PCR分析。c-d）TRV对照和沉默花瓣中的CIEL * a * b * 颜色参数（c）和叶绿素含量（d)。值表示三个生物学重复的平均值 ± 标准差。星号表示与野生型对照相比有显著差异的值（ * P<0.05，* P<0.01，*** P<0.001，双尾student’s t检验)。
PsLhcs在‘ LMYY’ 中的表达模式及序列分析
Lhcs作为光收集复合体中天线色素的协调者，在调节Chl水平中发挥重要作用 [21,38]。我们还重点研究了Lhcs在‘ LMYY ’花瓣褪绿中的功能表征。在' LMYY '花瓣转录组中鉴定出7个PsLhcs，从S3到S5均显著下调（表S5），表明PsLhcs在' LMYY '花瓣褪绿过程中发挥了重要作用。我们集中关注c72784.graph_c0和c27170.graph_c0，在花瓣褪绿中表达水平变化最为显著（S3 vs S5）。此外，我们还基于qRT-PCR探索了c72784.graph_c0和c27170.graph_c0的表达模式。与RNA-seq结果相似（图S4b和c）。
我们进一步通过BLAST比对在牡丹基因组中鉴定了PsLhc家族基因的所有成员 [39]，获得了23个PoLhcs。1 ~ 5号染色体上分别有4、5、6、5、3个PoLhcs，其中，Pos.gene23725 （c27170.graph_c0）和Pos.gene21676 （c72784.graph_c0）基因分别在2号和4号染色体上。为了理解进化关系和分组特征，构建了一个包含23个PoLhcs的系统发育树，同时还包括了来自拟南芥（A. thaliana）的21个和来自苹果（M. domestica）的27个Lhc蛋白（见图6b）。这23个PoLhcs被划分为五个亚家族，包括Lhca、Lhcb、CP24、CP26和CP29。在每个亚家族中，Lhca拥有最多的成员（11个），其次是Lhcb（8个）、CP29（2个）、CP26（1个）和CP24（1个）。其中，Pos.gene23725和Pos.gene21676分别属于CP26和Lhcb亚家族，它们最接近的蛋白分别是AtLhcb5和AtLhcb1。研究共鉴定出十个保守基序，这些保守基序的长度从11到50个氨基酸不等（见图6c，表S6）。根据这些结果，Pos.gene23725和Pos.gene21676分别被命名为PsLhcb5和PsLhcb1。
图6. Lhcs的特征分析。 a）Lhcs在P. ostii染色体上的位置。 b）使用基于p距离模型的邻接法构建的拟南芥、苹果和牡丹Lhcs的系统发育树，涉及71个氨基酸序列，采用成对删除法。 c）Lhcs中保守基序的分布。潜在的基序以不同颜色的框表示；详细内容请参考补充表S6。
PsLhcb1和PsLhcb5均能调控Chl的积累，抑制LMYY花瓣的褪绿
为了确定PsLhcb1和PsLhcb5在体内的功能，我们在烟草中异位过表达这两个基因。在随后的实验中，我们选择了3个高表达PsLhcb1（OE-14、OE-28和OE-29）和PsLhcb5（OE-5、OE-9和OE-16）的转基因品系。PsLhcb1-和PsLhcb5-OE系的叶片都比WT植株绿（图4a-d），且PsLhcb1和PsLhcb5-OE系叶片Chl含量显著高于WT植株（图4e-g），与叶片颜色一致。此外，PsLhcb1和PsLhcb5-OE的株高、叶片数、冠宽、单株果数和单果重均较WT植株显著增加（图S5），说明PsLhcb1和PsLhcb5-OE的生长活力高于WT植株。PsLhcb1和PsLhcb5也能提高烟草产量。
为了验证PsLhcb1和PsLhcb5在调节Chl含量中的作用，我们利用VIGS技术对 ’LMYY‘ 花瓣中的PsLhcb1和PsLhcb5进行了沉默。TRV对照的花瓣比PsLhcb1和PsLhcb5沉默品系更绿（图5a）， PsLhcb1和PsLhcb5在沉默系中的表达量相对于TRV对照分别显著降低了39.60%和43.56%（图5b）。PsLhcb1沉默系（L * 97.37, a * -6.65）和PsLhcb5沉默系（L * 95.98, a * -8.54）的L * 和 a * 值高于TRV对照（L * 87.60, a * -14.71）， b * 值与L * 和a *值呈相反趋势（图5c），与表型结果一致。与TRV对照（98.50 μg/g FW）相比，PsLhcb1和PsLhcb5沉默花瓣的Chl总含量（36.94 μg/g FW）和PsLhcb5沉默花瓣的Chl总含量（35.86 μg/g FW）显著降低（图5d）。这些结果表明，PsLhcb1和PsLhcb5提高了 ’LMYY‘ 花瓣的Chl含量，抑制了 ’LMYY‘ 花瓣的褪绿。
PsCLH1、PsLhcb1、PsLhcb5基因共表达网络及启动子分析
鉴于PsCLH1、PsLhcb1和PsLhcb5之间的功能关系，我们构建了PsCLH1、PsLhcb1和PsLhcb5的共表达网络。与这三种基因共表达的23个基因在光合作用、卟啉和叶绿素代谢、光合天线蛋白、次生代谢产物的生物合成以及代谢途径等生物学过程中富集，表明它们在维持花瓣绿色方面具有协调功能。与PsCLH1共表达的基因包括Chl合成酶（CHLG）、原叶绿素内酯还原酶A（PORA）和PORB、NYC1、叶绿素（ide）b还原酶（NOL）、HCAR和SGRL等与Chl代谢途径相关的编码酶。与PsLhcb1和PsLhcb5共表达的基因参与光系统反应，包括编码光系统蛋白的基因，即光系统Ⅱ蛋白D1（psbA）和psbB，以及其他chl结合蛋白（如LHCB3和LHCB6）（图7a和b）。在PsCLH1、PsLhcb1和PsLhcb5的启动子序列中发现了许多光响应顺式元件，证明了它们在光合途径中的关键作用（图7c）。此外，在它们的启动子上还发现了茉莉酸（MeJA）甲基化、生长素响应和MYB结合元件，提示可能受到植物激素和MYB转录因子的调控。
总的来说，我们的研究结果提出了一种调节 ’LMYY‘ 绿色花瓣开花期间Chl和花青素代谢平衡的模型（图8）。这两个过程之间的关系就像一个刻度，其中天平倾斜的一面表示一种颜色。PsLhcb1和PsLhcb5的表达调节了Chl的积累，促进了花瓣的绿化。PsCLH1的表达加速了Chl的降解，促进了花瓣的褪绿。S3是花青素生物合成途径基（CHI、F30H、DFR等）高表达的临界点，而Chl降解基因PsCLH1和PsLhcs协同调控开花期间 ’LMYY‘ 花瓣的Chl积累和褪绿。
图7。PsCLH1，PsLhcb1，PsLhcb5与启动子顺式元件的共表达网络。a）与PsCLH1、PsLhcb1、PsLhcb5共表达的基因。b）与PsCLH1、PsLhcb1和PsLhcb5共表达的基因的KEGG通路富集。c）PsCLH1，PsLhcb1和PsLhcb5启动子顺式元件的分布和富集。
图8。一种由Chl降解和花青素生物合成平衡调节的花瓣褪绿的假设模型。这两个过程之间的关系就像一个天平，天平倾斜的一面呈现出那个方向的颜色。PsLhcb1和PsLhcb5抑制花瓣褪绿，而PsCLH1促进花瓣褪绿。S3是花青素生物合成途径基因（CHI、F3’H、DFR等）在Chl降解开始时高表达的关键节点。
讨论
花的颜色是开花植物的一个重要特征，绿色的花在自然界中是非常罕见的。由于缺乏适当的模型，相关的研究仍然有限。我们利用牡丹 'LMYY' 品系作为研究模型，揭示了花瓣褪绿的分子机制。在花的发育和开花过程中，花瓣的颜色由黄绿色（S1）变为深绿色（S3），再由绿色变为淡绿色（S4），最后变为淡粉色（S5），与Chl和花青素水平一致。通过在烟草植物中过表达和在 ’LMYY‘ 花瓣中沉默三个关键的差异表达基因。提出了一种调节 ’LMYY‘ 绿色花瓣开花过程中Chl和花青素代谢平衡的模型。该研究将阐明我们对花色进化的认识，并为花色新品种的选育提供策略。
花瓣表皮细胞的形态和结构显著影响光的吸收和反射，从而影响花的颜色。色素沉着可受表皮细胞形状的影响。开花期间，靠近表皮的细胞呈圆锥形，增加了花青素对光的吸收，增强了花瓣的颜色 [40,41]。在五个不同的绿色花期，观察到表皮细胞的形态变化，这表明色素沉着较深的细胞比浅色的细胞表现出更多的褶皱和更密集的排列。在两种颜色并存的S4期，表皮细胞的形态差异尤为明显。牡丹中绿色花瓣的因果关系需要进一步的表征，因为迄今为止在牡丹中报道的研究有限。在其他植物中也有类似的发现，表皮细胞较平的彩色马蹄莲花瓣表皮细胞反射的光线较多，花瓣颜色较浅 [42]。石斛花中表皮细胞的形状可能导致花瓣颜色的差异，深色花瓣唇部表皮细胞的圆锥形程度高于浅色花瓣 [43,44]。牛鼻草花瓣表皮细胞由圆锥形变为扁平，花瓣颜色也由深色变为浅色 [45]。表皮结构产生的结构色可能通过花瓣的色彩和图案影响传粉昆虫的信号传递 [41]，但绿色花瓣的花瓣细胞结构在功能中的作用有待进一步研究。上述结果量化了牡丹绿花的颜色表型，为进一步研究其潜在的显色机制和选育创新品种奠定了基础。在未来，应该筛选和鉴定与表皮细胞形状相关的基因，以了解它们在影响牡丹花颜色中的作用。
CLH是Chl降解的初始酶和限速酶，它将Chl水解生成脱植基叶绿素和植物醇 [18,46]。在许多植物物种中，CLH活性与Chl含量呈负相关，直接控制着Chl的降解，如胡椒 [47]和柑橘柠檬 [48]。然而，所进行的研究在这方面得出了相互矛盾的结果。在拟南芥中，clh1和clh2单敲除系和双敲除系没有抑制Chl的降解，这表明CLH不是Chl降解所必需的 [49,50]。功能表征表明，PsCLH1的上调表达加速了Chl的降解，这表明PsCLH1 在 ’LMYY‘ 绿色花瓣的叶绿素降解过程中是必不可少的。然而，PsCLH1的表达水平与叶绿素含量呈正相关，在S3阶段达到最高水平。基于多项研究，叶绿素酶作为叶绿素降解过程中的限速酶，受到翻译后调控的控制，从而发挥其潜在功能[18]。PsCLH1在“绿幕隐玉”绿色花瓣中是否以及如何发生翻译后调控，需要进一步研究。
Lhcs广泛参与高等植物的叶、花、果生长发育等生物过程。在麻疯树 (15) [36]、葡萄树 (20)[23]、家蝇 (27)[36]、陆地棉 (55)[51]等多种植物中都发现了Lhcs家族成员，在数量上存在显著差异。然而，有关牡丹的相关研究尚未见报道。对牡丹Lhcs家族成员进行了全基因组鉴定，获得23个Lhcs家族成员，分布在5条染色体上，其中PsLhcb1和PsLhcb5具有功能特征。在烟草中的转基因和 ’LMYY‘ 花瓣的沉默实验表明，这两个基因增加了Chl含量，影响了花瓣褪绿。近年来，在茶（LHCⅡ, CSA035910）[52]、紫薇（叶绿素a/b结合蛋白基因，CAB1）[53]、陆地棉（Lhcb2.3）[51]和猕猴桃（Lhcb3.1/3.2）[38]中发现Lhcs成员促进Chl积累和控制叶片绿度，但首次在绿色花瓣中发现Lhcs的功能特征。在烟草中增强PsLhcb1和PsLhcb5的表达后，其生长活力比WT植株更旺盛，果实产量也有所提高，这与水稻的结果一致 [54,55]。为了提高光能捕获能力和提高单位土地面积产量，未来可以利用Lhcs进行种质创新，突破产量限制。
我们发现PsCLH1与NYC1、NOL、HCAR和SGRL共表达，表明这些基因也可能在 ‘LMYY’ 花瓣褪绿过程中发挥重要作用。NYC1、NOL、HCAR和PAO的突变可导致绿色表型的保持 [56-59]，这表明SGRL蛋白在Chl降解的早期阶段起着至关重要的作用[60]。此外，Chl与PSⅠ和PSⅡ复合物中的Chl结合蛋白相关 [61]，并在产生PSⅠ和PSⅡ的组织中积累。我们发现Lhcs在PSⅡ的不同亚基中与Psb基因共表达。然而，上述基因在牡丹花瓣中的功能尚不清楚，需要进一步研究。与花瓣变绿相关的酶基因和转录因子表明，增加CONSTANS-like16（COL16）或过表达抑制因子（SOC1）导致拟南芥、矮牵牛和烟草的花瓣变绿 [62,63]。TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/ PCF4 （TCP4）通过直接结合PORB、DIVINYL REDUCTASE（DVR）和SOC1启动子来控制花瓣的绿度 [15]。在我们的研究中，在PsCLH、PsLhcb1和PsLhcb5的启动子序列中发现了许多顺式元件。因此，对转录调控的研究将是未来一个有趣的话题。目前的研究大多集中在花青素代谢的转录调控上，进一步研究Chl和花青素代谢途径相关基因的时空表达调控，对于理解器官特异性Chl和花青素积累平衡的遗传基础具有重要意义。该研究为牡丹花色的调控和分子育种提供了理论依据，为其他观赏植物绿花新品种的培育提供了参考。预计这将有助于在花卉产业内创造更大的经济价值。我们将进一步研究绿色花卉的化学和分子生物学机制，以期产生更多的工业和科学价值。
结论
在这项研究中，我们发现花瓣颜色从绿色到淡粉色的变化与Chl和花青素的水平一致。在Chl积累过程中鉴定出3个关键基因，其中PsCLH1促进叶片褪绿，而PsLhcb1和PsLhcb5抑制叶片褪绿。我们的研究结果阐明了花瓣绿色维持的分子机制，为潜在的花色进化和花色创新品种的选育提供了新的思路。
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