细胞凋亡的流式检测？实验步骤+结果解读，速戳！ | MCE

凋亡如何测？流式图看不懂？简简单单教你读懂凋亡流式图！！！！做个流式小能手~~

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什么是凋亡？

细胞凋亡 (Apoptosis)，或者说是程序性细胞死亡，是细胞遵循自身基因指令进行的一种有条不紊的自我毁灭过程。这个过程在生物体的正常发育和维持健康状态中扮演着重要角色，并且在一些疾病状态下也会发生[1]。

细胞凋亡会产生什么样的变化呢？

早期阶段，你会看到细胞开始皱缩变小，细胞核会破裂成碎片，同时细胞表面会出现一些泡泡状的小突起，最终这些突起会分离出来，形成含有细胞内部物质的小包，我们称之为“凋亡小体”。有趣的是，尽管细胞正在分解，但它的外层膜仍然保持完整，确保了细胞内容物不会随意泄漏出去。

图 1. 细胞凋亡过程。

除此之外，细胞内部还会发生一系列化学反应，例如激活特定的酶 (Caspase)，这些酶会进一步切割其他蛋白质，像 PARP 这样的底物。还有，线粒体中的细胞色素 c 会被释放到细胞质中，DNA 会被切割成小片段。细胞膜也会发生变化，比如位于膜内侧的磷脂酰丝氨酸 (PS) 会翻转到外侧，同时线粒体膜电位也会改变。最后，调控细胞生死命运的蛋白家族成员，如 Bax、Bid、Bcl-2 等，它们的表达量也会有所调整，以促进或抑制细胞凋亡的过程[1][2][3]。

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如何检测凋亡呢？

那怎么检测细胞凋亡呢？我们在这介绍了两种流式检测方法，如果你感兴趣的话让我们一起看下去吧~

首先，最常用的细胞凋亡检测方法是 Annexin V/PI 双染法。

Annexin V 是一种依赖钙离子的蛋白质，能特异性地绑定到细胞膜上的磷脂酰丝氨酸 (PS)。在健康细胞中，PS 位于细胞膜内侧；而在凋亡早期，PS 会移到外侧。因此，用荧光标记 (如 FITC) 的 Annexin V 可以检测到这个变化，表明细胞开始凋亡。

PI (碘化丙啶) 是一种红色荧光染料，它不能进入活细胞或早期凋亡细胞，但可以进入已经死亡或晚期凋亡细胞，因为这些细胞的膜已经破损。

所以，通过 Annexin V 和 PI 的结合使用，我们可以区分早期凋亡、晚期凋亡和坏死的细胞。这种方法可以通过流式细胞仪或荧光显微镜轻松完成检测。

其次，我们还可以检测线粒体跨膜电位 (∆ΨM)，在具有较高 ∆ΨM 的健康细胞中，JC-1 染料可进入细胞并在线粒体中积累，形成 J-aggregates 发出橙红色荧光。在凋亡细胞中，∆ΨM 较低，JC-1 染料进入线粒体较少，以单体形式存在发出绿色荧光。

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案例: Annexin V/PI 法检测

接下来，让我们一起来看看 Annexin V/PI 法检测实战吧！

案例一

为了探究敲低 MUC16 对鼻咽癌细胞系 C666-1 和 HK-1 的糖酵解以及免疫逃逸能力的影响，作者利用Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒 (HY-K1073) 评估了鼻咽癌细胞在不同处理条件下的凋亡情况[4]。

图 2. 流式细胞术显示 C666-1 和 HK-1 细胞中 MUC-16 的缺失诱导了细胞凋亡[4]。

a. 活细胞中，不可检测到 Annexin V-FITC/PI 的荧光。因为活细胞的细胞膜完整，不结合 Annexin V-FITC，PI 也无法穿过细胞膜进入细胞，不发光。

b. 早期凋亡细胞中，可以检测到 Annexin V-FITC 的荧光，但不可检测到 PI 的荧光。因为细胞膜磷脂酰丝氨酸 (PS) 外翻，Annexin V 可以结合，但细胞膜完整，PI 无法穿过细胞膜进入细胞，显示出绿色荧光。

c. 晚期凋亡细胞中，均可以检测到 Annexin V-FITC/PI 的荧光。因为细胞膜的完整性被破坏，Annexin V-FITC/PI 都可以进入细胞，显示出绿色和红色荧光。

d. 流式图的纵坐标是 PI，在左上 (Q1-UL) 区域，发出红色荧光，红色荧光越强，表示细胞死亡越严重。流式图的横坐标是 Annexin V-FITC，在右下 (Q1-LR) 区域发出绿色荧光，绿色荧光越强，表示早期凋亡细胞越多。左下 (Q1-LL) 是正常细胞，不发光。右上 (Q1-UR) 是晚期凋亡细胞和坏死细胞，发出绿色和红色两种荧光。

案例二

为了评估不同浓度的 1,25(OH)2D3 对头肾巨噬细胞 (HKMs) 细胞活力的影响，作者利用 Annexin V-iFluor 488/PI (HY-K1080) 检测细胞凋亡[5]。

图 3. 流式细胞术检测 1,25-(OH)2D3 对 HKMs 细胞凋亡的影响[5]。

a. 1,25(OH)2D3 未处理组活细胞百分比为 24.8%。

b. 1 nM 处理组肝细胞百分比为 36.1%。

c. 10 nM 处理组活细胞百分比为 56.3%。

d. 100 nM 处理组活细胞百分比为 40.8%。

e. 流式图的横坐标是 FL1-H (FITC-H) 代表 Annexin V-iFluor 488 的荧光强度。Annexin V-iFluor 488 用于检测早期凋亡细胞。流式图纵坐标是 SSC-H (SSC-H) 代表侧向散射光强度，用于检测细胞的颗粒性和细胞内结构的复杂性，侧向散射光强度通常与细胞内颗粒物的大小和数量有关。

f. 低侧向散射 (SSC-H) 和低 Annexin V-iFluor 488 荧光强度 (FL1-H)。通常代表活细胞。高侧向散射 (SSC-H) 和高 Annexin V-iFluor 488 荧光强度 (FL1-H)。通常代表细胞凋亡晚期或坏死细胞。高侧向散射 (SSC-H) 和低 Annexin V-iFluor 488 荧光强度 (FL1-H)。通常代表细胞凋亡早期。低侧向散射 (SSC-H) 和高 Annexin V-iFluor 488 荧光强度 (FL1-H)。通常代表细胞凋亡早期。

Annexin V/PI 法检测实验步骤和注意事项

(以 HY-K1073 为例)

1． 细胞与 Annexin V-FITC 和 PI 孵育

1.1 收集细胞：收集 1-5 × 105 个细胞。

• 悬浮细胞：1000 g 离心 5 min，弃去上清。加入 1 mL 预冷的 PBS 轻轻重悬细胞沉淀，1000 g 离心 5 min，弃去上清，保留细胞沉淀。
• 贴壁细胞：小心吸取细胞培养液保存备用。加入 PBS 洗涤后，加入适量胰酶消化液 (尽量不含 EDTA，以免影响 Annexin V 和 PS 的结合) 消化细胞。加入前面收集的培养液，轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，1000 g 离心 5 min，弃去上清。加入 1 mL 预冷的 PBS 轻轻重悬细胞沉淀，1000 g 离心 5 min，弃去上清，保留细胞沉淀。注：建议胰酶消化液不含 EDTA。

2. 加入 195 μL Binding Buffer，轻轻重悬细胞。

3. 加入 5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。

4. 加入 10 μL PI Stain，轻轻混匀。

5. 室温下避光孵育 10-20 min。

注：孵育过程中可轻轻颠倒数次以加强染色效果。

6. 流式细胞仪检测：用流式细胞仪检测荧光强度。

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注意事项

a. 流式检测时，Annexin V-FITC 最大激发波长为 488 nm，最大发射波长为 525 nm，在 FL1 通道检测；PI-DNA 最大激发波长为 535 nm，最大发射波长为 617 nm，在 FL2 或FL3 通道检测。

b. 建议设置三组对照：未染色组、PI 单染组及 Annexin V-FITC 单染组。

c. 所有操作应尽量快速，避免细胞长时间暴露于非生理条件下。

d. 染色后的样本需尽快分析，以防止染料信号减弱影响结果准确性。

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案例:

JC-1 法检测线粒体跨膜电位

那么 JC-1 法检测线粒体跨膜电位是怎么做的呢？一个案例带你读懂 JC-1 法！

文献中为了检测人参皂苷 Rd 在高糖条件下对细胞状态的影响，利用 JC-1 (HY-15534) 检测线粒体膜电位变化[6]。

图 4. 流式细胞术显示人参皂苷 Rd 和 NAC 对高糖诱导的线粒体功能障碍具有保护作用[6]。

a. 高糖处理 (HG) 导致线粒体膜电位下降，表现为绿色荧光增加。

b. 人参皂苷 Rd 和 NAC 均能部分或完全恢复高糖处理导致的线粒体膜电位下降，表现为绿色荧光减少，红色荧光增加。

c. 人参皂苷 Rd 的效果随着浓度的增加而增强。

实验步骤与注意事项

一、JC-1 染色液的配制

• 制备储存液

用 DMSO 配制 5 mg/mL 的 JC-1。如用 1 mL DMSO 溶解 5 mg JC-1。

注意：1) JC-1 储存液建议分装后于 -20℃ 或 -80℃ 避光保存。

• 工作液的配制

用预热好的无血清细胞培养基或 PBS 稀释储存液，配制成 1-20 μg/mL 的 JC-1 工作。

注意：

1) 请根据实际情况调整 JC-1 工作液浓度，且现用现配。

2) 如果 JC-1 进入细胞的效果不好，可向工作也液中加入适量 20% Pluronic F127 溶液，终浓度为 0.02-0.05%，Pluronic F127 可以防止 JC-1 在缓冲液中聚合并帮助其进入细胞。

二、JC-1 染色

1. 以 6 孔板为例进行细胞铺板，密度为 5×105 cells/mL。37℃，5% CO2 培养箱培养过夜。

注意：进行凋亡诱导时的细胞密度建议不超过 1×106/mL，也可根据自己的细胞类型培养至合适的密度。

2. 取 0.5 mL 细胞悬液至无菌的离心管内。

3. 400 g 离心 3-5 min；弃上清。

4. 用 1 mL JC-1 工作液重悬细胞，于 37℃，5% CO2 培养箱孵育 15-30 min。

5. 室温条件 400 g 离心 5 min；吸掉上清。

6. 用 2 mL 细胞培养液或者缓冲液重悬细胞，之后室温条件 400 g 离心 5 min；弃上清，重复两次。

7. 用 1 mL 新鲜培养液或者缓冲液重悬细胞，立刻进行后续的流式分析或荧光显微镜观察。

8. 数据分析 (流式细胞仪)：含有红色 JC-1 聚集物的健康细胞线粒体用 FL2 通道检测；含有绿色 JC-1 单体的凋亡或不健康细胞用 FL1 (FITC) 通道检测。

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小结

用流式细胞术检测细胞凋亡，你学会了吗？如果你觉得这篇干货满满的凋亡检测方法有帮助，记得动动小手点赞收藏哦！！！我们下期见，为大家带来更多的科研小干货~

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[1] Susan Elmore, et al. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 2007 Jun;35(4):495-516.

[2] Rebecca C Taylor, et al. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 Mar;9(3):231-41.

[3] Anna Chmurska, et al. Two Faces of Autophagy in the Struggle against Cancer. Int J Mol Sci. 2021 Mar 15;22(6):2981.

[4] Yueyang Liu, et al. Hypomethylation-associated ELF3 helps nasopharyngeal carcinoma to escape immune surveillance via MUC16-mediated glycolytic metabolic reprogramming. Am J Physiol Cell Physiol. 2024 Sep 2;327(4):C1125–C1142.

[5] Fengxia Zhao, et al. Oral administration of high-dose vitamin D3 can effectively suppress Nocardia seriolae infection in largemouth bass (Micropterus salmoides). Aquaculture. Volume 595, Part 2, 30 January 2025, 741643.

[6] Kai Tang, et al. Ginsenoside Rd ameliorates high glucose-induced retinal endothelial injury through AMPK-STRT1 interdependence. Pharmacol Res. 2022 May:179:106123.