【转载】扩增子测序数据标准化——随机重抽样(Subsample)

在扩增子测序数据分析时，需要对每个样本的序列总数做标准化，即通过随机重抽样(subsample，也作resample)，使每个样本含有相同数目的序列。标准化的OTU/ASV丰度表是计算alpha多样性、beta多样性（例如PCoA、NMDS排序图）所必需的。建议使用同一套标准化的OTU/ASV丰度表做所有的后续分析。

标准化的策略有两种，一是对原始序列做随机重抽样，二是对OTU/ASV丰度表做随机重抽样。我个人认为策略二更合适，因为从原始序列到最终的OTU/ASV丰度表有多个步骤，质控、嵌合体去除、Singleton去除、线粒体/叶绿体去除 (16S rRNA) 等步骤都会损失一些序列。

网上曾有一个Perl语言编写的脚本叫做daisychopper.pl (原链接已经失效了，目前在网上很难找到)，它可以执行上述两种标准化策略，不过有两点小瑕疵：一是由于不必要的检测步骤导致运行速度较慢，二是需要对OTU丰度表进行格式转换才能正确执行策略二。

因此，我后来干脆自己重新写了个Perl脚本去做OTU丰度表的标准化，叫做subsample_in_table.pl，下载方法见本文底部，运算速度快了许多。这个脚本需要使用命令行执行，例如Windows系统的命令提示符（CMD）、Linux和macOS系统的终端。运行脚本时，如果不提供任何参数，会显示脚本的帮助信息（例如全部参数的说明）。当然，电脑上得安装有perl语言，可以从网上下载Strawberry Perl或ActivePerl安装。

该脚本用法如下：

perl subsample_in_table.pl -i [输入文件] -o [输出文件] -s [样本数目] <可选参数>

输入文件每列为样本，每行为物种 (例如OTU、ASV)或功能，额外信息如物种分类可以放在表格的最后几列，输出文件中会保留这些额外信息。需要注意的是，脚本和输入文件需要指定所在路径，如果您不明白路径的用法，可以直接把这个脚本文件和输入文件放在同一目录，在命令行工具中用cd命令进入该目录，再执行上述命令。

-o参数指定输出文件名称，默认为"otu_table_resample.txt"。

可以通过参数-n指定标准化到多少条序列，如果缺省，则按含有最少序列的那个样本计算。

重抽样会导致一些稀有OTU/ASV从全部样本中消失，可以通过参数-z从表格中去除这些OTU/ASV，以免干扰后续分析。

除此之外，另有几个与OTU/ASV丰度表处理有关的脚本，个人认为比较好用，在此一并分享：

1. alpha_diversity.pl

该脚本基于物种丰度表（例如OTU表、ASV表）计算alpha多样性，例如Observed species, Chao1 richness, Shannon diversity, Simpson index, Pielou evenness (均匀度), Good's coverage (覆盖度)等。

输入文件可以是重抽样后的OTU/ASV表，额外信息如物种分类可以放在表格的最后几列。用法如下： 

perl alpha_diversity.pl -i [输入文件] -o [输出文件] -s [样本数目]

2. percent_in_table.pl

该脚本可将包含序列数目的物种丰度表（例如OTU表、ASV表）转化为百分数(不显示%符号)表格。

输入文件可以是重抽样后的OTU/ASV表，额外信息如物种分类可以放在表格的最后几列。用法如下： 

perl percent_in_table.pl -i [输入文件] -n [样本数目]

3. sum_taxa_from_otu_table.pl

该脚本基于物种丰度表（例如OTU表、ASV表）计算每个分类水平的物种总丰度，例如Clostridium属在每个样本中的丰度。 分级的的COG、Subsystems、KO功能表也可以作为输入文件，统计每个功能的丰度。用法如下： 

perl sum_taxa_from_otu_table.pl -i [输入文件] -s [样本数] -D [数据类型] -t [分类等级数] <其他可选参数>

-D: 输入文件的数据类型 (0或1，默认 0)，0代表百分比 (不含%，即percent_in_table.pl的输出文件)，1代表序列数目 (例如重抽样后的OTU/ASV表)。

-t: 物种分类有几个等级 (水平)，默认为6。物种分类请放在输入文件的最后几列，例如界、门、纲、目、科、属六列 (图1)，则对应的输出文件是taxa_L1.txt ~ taxa_L6.txt，它们不包含当前分类下的未分类序列丰度（每个样本的总和可能低于100%）。

如果使用参数-a 1，会额外得到taxafull_L1.txt ~ taxafull_L6.txt，它们包含当前分类下的未分类序列丰度（也就是说，每个样本的总和为100%），例如Actinobacteria门下所有分不到纲的序列会汇总为unclassified Actinobacteria。

图1. 带有物种分类信息的OTU表

以上自编Perl脚本可以从GitHub下载：https://github.com/PeterRui/perl4amplicon

如果GitHub打不开，也可以从这篇文章的补充材料下载Data Sheet 2.zip：

Rui J, Zhao Y, Cong N, Wang F, Li C, Liu X, Hu J, Ling N and Jing X (2023) Elevational distribution and seasonal dynamics of alpine soil prokaryotic communities. Front. Microbiol. 14:1280011. doi: 10.3389/fmicb.2023.1280011

原文链接：科学网—扩增子测序数据标准化——随机重抽样(Subsample) - 芮俊鹏的博文