ACS Catal | 从两种二萜合酶(IrTPS2/IrKSL3a)的功能可塑性到酶的进化-CSDN博客

2024年2月12日，中医科学院黄璐琦、崔光红课题组联合中山大学巫瑞波课题组在ACS Catalysis上发表了题为 “From Functional Plasticity of Two Diterpene Synthases (IrTPS2/IrKSL3a) to Enzyme Evolution”（从两种二萜合酶(IrTPS2/IrKSL3a)的功能可塑性到酶的进化）的文章。

第一作者：Baolong Jin，Kangwei Xu，Juan Guo

通讯作者：Guanghong Cui，Ruibo Wu，Luqi Huang

DOI：doi.org/10.1021/acscatal.3c05918

背景

萜类化合物具有多种多样的结构和生物活性，其复杂性很大程度上源于萜烯合酶(terpene synthases，TPS)。这些酶可催化碳正离子的级联反应，然而其中负责淬灭最终正离子的基团在很大程度上是未知的。冬凌草Isodon rubescens来源的 IrKSL3a 和 IrTPS2 具有 98% 的序列同源性，并且都以(+)-CPP为底物，但不同的猝灭策略使其产生不同的产物，其中 IrKSL3a 通过去质子化直接生成Isopimaradiene（1），而 IrTPS2则是通过加水生成羟基化的Nezukol (2) （Figure 1b）。

研究结果

一、IrKSL3a 和 IrTPS2的特异性由一个关键氨基酸残基决定2

序列比对显示在活性口袋附近IrKSL3a 与 IrTPS2之间仅有5个残基的差异（Figure 1c），作者将IrTPS2五个位点的残基一一替换为IrKSL3a的残基。同先前在其他同源蛋白中得到的结果相同，IrTPS2:A523I突变体几乎完全产生1，而其余四种突变则未影响产物选择。然而研究人员用与异亮氨酸大小相似的亮氨酸进行同样的突变，IrTPS2:A523L 却继续产生羟基化产物 2（Figure 2a）。

二、酶中存在对邻近的 β-甲基敏感的水结合二联体

为了进一步研究酶结构与功能的关系，作者将底物 (+)-CPP与三个二价镁 (Mg²⁺) 辅因子一起对接到建模的野生型和突变体中，并进行了分子动力学 (MD) 模拟和QM/MM优化。野生型IrTPS2的T527 和 S499 均能与C8附近 (∼4Å)的水分子形成氢键，作者推测该水分子可能是羟基供体（Figure 3）。

尽管侧链中甲基的位置仅有轻微差异，但模拟显示IrTPS2:A523I 与 IrTPS2:A523L 的结构具有非常显著的差异。IrTPS2:A523I 中的水位点被 I523 的 β-甲基占据，阻止了水分子淬灭 C8 碳正离子中间体。相比之下 IrTPS2:A523L 中的亮氨酸远离底物，水分子仍可与 T527 和 S499 结合（Figure 3），模拟结果与 C8 附近水分子的存在与否决定是否形成羟基化产物的假设一致。为了进一步研究 β-甲基的普遍影响，作者通过相同的计算策略发现 IrTPS2 的 A523T 和A523V 突变体也能阻碍水分子与 T527 和 S499 的结合。两突变体的功能验证进一步证实了计算结果（Figure 2b）。

虽然A523I突变对IrTPS2有影响，但IrKSL3a（I522A）的逆向突变仅产生极少量的产物2，同时产物1的量大大减少，其功能并没有完全逆转。作者假设这是由于 IrKSL3a 中的498位残基是丙氨酸而不是IrTPS2 (S499) 中与水形成氢键的丝氨酸。为此，作者进一步构建了 IrKSL3a:A498S/I522A。结果表明，这种双突变体可以产生更多的 2。在此基础上获得的三取代突变体 IrKSL3a:A498S/I522A/E632K 和四取代突变体IrKSL3a:A498S/I522A/E632K/L523I 可更特异性地产生 2（Figure 2c）。值得注意的是，作者观察到IrKSL3a:I522T/E632K突变体产生了四个额外的二萜产物，进一步测试表明，IrTPS2:A522T也可制备出这些物质(Figure 1b)。

这些实验和计算结果表明，S499 和 T527 的氢键结合能力是IrTPS2 合成 2所必需的，且可以通过关键氨基酸残基的突变实现与IrKSL3a 功能的转换。

三、IrTPS2 和 IrKSL3a 的淬灭机制

为了进一步研究 IrTPS2 的催化机制，作者通过QM/MM进行了自由能计算（Figure 4a）。将(+)-CPP替换为相关的碳正离子中间体，随着无机焦磷酸以及三重 Mg²⁺的释放，生成了第一个中间态 (IM1) 。自由能曲线表明，加水过程非常容易，因为它放热且几乎没有能量势垒。借助阳离子与C8碳正离子的极性相互作用，由S499和T527氢键连接的水分子（Wat）逐渐接近反应物，在过渡态（TS）中T527和Wat之间的氢键距离为1.9 Å，比IM1态的氢键距离（2.6 Å）短，而S499和Wat之间的氢键距离增加。这种转变在动力学上非常有利，其驱动力来自于加水后形成的烷氧基鎓反应物（IM2）使稳定性提高。

作者还用QM/MM计算了野生型IrKSL3a通过去质子化产生1的自由能曲线（Figure 4b）。模型结构表明，T526 的羟基是唯一可能进行去质子化的官能团。虽然最初的 QM/MM 自由能计算表明，这种去质子化的能量势垒约为 20.9 kcal/mol，使用 T526 去质子化生成 1需要吸收大量热（∼17.1 kcal/mol）（Figure 4b, path A），但还存在另一条路经，通过I522的酰胺键与T526形成氢键使T526的羟基在去质子化过程中正确定位，并通过稳定T526的质子化形式提高其碱性，从而使能量势垒降低到17.0 kcal/mol。（Figure 4b, path B）。此外，用其他氨基酸取代 T526 会显著降低催化活性进一步证实了T526的重要性。

四、蛋白工程获得了更多合成Nezukol的酶

为了确定关键氨基酸位点功能是否普遍适用，作者对来自不同唇形科物种的同源蛋白进行了点突变获得变体 MsTPS1:I509A、OmTPS5:M353A、MvELS:I326A、SsSS:S333A和SmKSL1:I338A。结果表明，除SsSS:S333A之外的所有变体中均可检测到羟基化产物2，其产量按 MsTPS1:I509A > OmTPS5:M353A > MvELS:I326A > SmKSL1:I338A的顺序降低，显示 2 产量与酶和 IrTPS2 的同源性正相关（Figure 5a）。

为了研究水结合二联体（即 IrTPS2 中的 S499 和 T527）的作用，在上述四个单取代变体的基础上又进行了相关残基的突变。鉴于上述 T527 的保守性，所有四个变体中的 T527 都被缬氨酸取代，除此之外，用丙氨酸替换 MsTPS1 和 OmTPS5 保守的S499，用丝氨酸替换 MvELS 和 SmKSL1 的A499（Figure 5b）。与上文所示的 T527 的重要性相一致，除MsTPS1中仍能观察到少量的2外，其余突变体均无2的产生（Figure 5c）。与此相反，将 MvELS 和 SmKSL1 中的丙氨酸改为丝氨酸的影响微乎其微，虽然将 OmTPS5 和 MsTPS1 中的 S499 改为丙氨酸确实减少了 2 的生成量，但影响相对较小（Figure 5c）。这些结果进一步突出了3个残基的重要性，然而它们的效果进一步依赖于其他因素，IrKSL3a 也需要额外的突变来表现出2的选择性合成。这表明 IrTPS2中羟基化功能的获得经过了多步进化。

总结与讨论

作者通过对 IrTPS2 和IrKSL3a 的分子建模和分子动力学分析和 QM/MM 计算，发现了S499 和 T527两个影响酶羟化反应的关键二联体，且T527 很有可能参与酶催化过程，所有计算结果均通过突变实验进行了验证。将这些关键残基引入关系更远的 I 型 diTPSs 进一步检验了此结果的普适性和进化意义。具体来说，这三个关键残基（对应于 IrTPS2 中的残基位点 523/499/527）对于引入水催化羟化是必须的，但需要酶内的其他残基辅助才更有效，进而重塑功能，表明 IrTPS2 进化产生 Nezukol 的过程中存在选择压力。

研究展望

1、作者只对IrKSL3a的同功蛋白进行了进化上的正向突变，除此之外，还可以对IrTPS2的同功蛋白进行逆向突变已验证关键氨基酸的进化关系；

2、作者没有对新出现的产物进行进一步的研究，可以继续探究新产物产生的原因与机制；

3、尽管将本研究中发现的关键氨基酸进行突变可以使其产生羟化产物，但其产量极低且仍有大量烯烃产物，想要重塑Ⅰ型diTPS的功能还需要进一步的研究。