通过HipSTR 对二代测序（NGS）数据进行 短串联重复序列（short tandem repeats，STR）检测

人类基因组DNA有30亿个碱基（bp），其中10%是串联重复序列，称为卫星DNA。按重复单位的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。

STR: 短串联重复序列（short tandem repeats，STR）也称微卫星DNA（microsatellite DNA）, 通常是基因组中由1~6个碱基单元组成的一段DNA重复序列。STR序列符合孟德尔遗传定律，个体间存在相同的短串联重复序列，但重复的次数在个体间存在差异，形成片段长度不等的等位基因。由于核心单位重复数目在个体间呈高度变异性并且数量丰富，构成了STR基因座的遗传多态性。

通常STR检测是对基因组特定STR区域进行PCR扩增，电泳，然后进行STR分型鉴定。如下图所示，当一个STR出现单峰时，说明该个体在该STR区域，为纯合，出现双峰则说明两条染色体的STR重复次数不同，为杂合。

一般情况下，每一个STR位点会被约5-20％的人们所共有，当同时鉴别多个STR位点时，通过最终的STR图谱可以非常精确地鉴别每个个体。理论上联合应用16个STR位点，其个体的识别率可达0.999999999998。
所以当拿到自己新得的细胞系，或者传代很多的细胞系，不确定其是否存在污染时，就可以检测STR，通过与标准细胞库的细胞系STR图谱比较，从而确定细胞系的纯度。

鉴定STR的方法除了PCR外，还可以通过NGS的方法进行检测。

通过NGS数据进行检测的软件：
TSSV：https://pypi.org/project/tssv/
lobSTR：https://sourceforge.net/projects/lobstr/
STRait Razor：https://github.com/Ahhgust/STRaitRazor#documentation
HipSTR：https://github.com/tfwillems/HipSTR
STRSCan：http://darwin.informatics.indiana.edu/str/

以 HipSTR 为例：

git clone https://github.com/HipSTR-Tool/HipSTR
cd HipSTR
make
./HipSTR --help

安装完成后目录结构便是这样的。

如果出现软件的说明文档就说明安装成功了。

软件说明中数据是使用 “ Illumina whole-genome sequencing data ”，即 Illumina平台测序的全基因组数据，最好是在30X以上。

软件需要的输入文件是bam文件，可以使用--bams 参数输入各个bam文件，逗号隔开；或者使用--bam-files ，参数是包含所有bam的文件，一行一个bam文件。
--fasta 则是mapping时使用的参考基因组。
--regions 是关注的STR所在的bed区域。
--str-vcf 是VCF格式的输出文件结果。
hg19 基因组上STR bed文件：https://github.com/HipSTR-Tool/HipSTR-references/raw/master/human/hg19.hipstr_reference.bed.gz
hg38 基因组上STR bed文件：https://github.com/HipSTR-Tool/HipSTR-references/raw/master/human/hg38.hipstr_reference.bed.gz

bed文件格式如下图，第1-5列是必须的，分别是STR所在染色体，起始位置，终止位置，最小重复单元碱基数，重复次数。后边列为可选，分别是STR名称，以及序列。

使用参数如下：

./HipSTR --bams          run1.bam,run2.bam,run3.bam,run4.bam
         --fasta         genome.fa
         --regions       str_regions.bed
         --str-vcf       str_calls.vcf.gz

根据样本量的大小以及数据量的大小，可选参数：

--min-reads   #进行分型时所需的最小reads数，当测序深度较低，reads较少时，可以通过改参数降低阈值（默认为100）
--max-str-len  # STR序列的最大长度，大于该值时不被检测，如果一些STR较长，可以调节该参数

./HipSTR --bams          run1.bam,run2.bam,run3.bam,run4.bam
         --fasta         genome.fa
         --regions       str_regions.bed
         --str-vcf       str_calls.vcf.gz
         --min-reads     5 
         --max-str-len   300

软件在检测过程中，会自动使用 stutter-model （伪影模式？）的 EM algorithm 算法模型，对区域内的序列进行一些调整。如果样本，或者reads太少的话，用这个模型可能检测不出来，因为如果不符合EM algorithm所需的条件，这个位点就会被略过，这时可以使用--def-stutter-model 使用默认的模型。

./HipSTR --bams          run1.bam,run2.bam,run3.bam,run4.bam
         --fasta         genome.fa
         --regions       str_regions.bed
         --str-vcf       str_calls.vcf.gz
         --min-reads     5 
         --max-str-len   300
         --def-stutter-model

运行还是非常快的。输出结果为vcf格式文件。然后根据Ref, Alt ,以及info列的GT 就可以知道样本的STR基因型了， BPDIFFS 则是每个alt与ref的碱基差异数。

STR数据库： https://strbase.nist.gov
STR marker的序列信息特征：https://strbase.nist.gov/fbicore.htm

ATCC数据库：https://www.atcc.org/Products/Cells_and_Microorganisms/Testing_and_Characterization/STR_Profiling_Analysis.aspx
ATCC数据库细胞系STR查询向导文件：https://www.atcc.org/~/media/Documents/ATCC_STR_Database_Tutorial.ashx