如何对基因组序列进行注释-CSDN博客

基因组组装完成后，或者是完成了草图，就不可避免遇到一个问题，需要对基因组序列进行注释。注释之前首先得构建基因模型，有三种策略：

从头注释(de novo prediction)：通过已有的概率模型来预测基因结构，在预测剪切位点和UTR区准确性较低
同源预测(homology-based prediction)：有一些基因蛋白在相近物种间的保守型搞，所以可以使用已有的高质量近缘物种注释信息通过序列联配的方式确定外显子边界和剪切位点
基于转录组预测(transcriptome-based prediction)：通过物种的RNA-seq数据辅助注释，能够较为准确的确定剪切位点和外显子区域。

每一种方法都有自己的优缺点，所以最后需要用EvidenceModeler(EVM)和GLEAN工具进行整合，合并成完整的基因结构。基于可靠的基因结构，后续可才是功能注释，蛋白功能域注释，基因本体论注释，通路注释等。

那么基因注释重要吗？可以说是非常重要了，尤其是高通量测序非常便宜的现在。你可以花不到一万的价格对600M的物种进行100X的普通文库测序，然后拼接出草图。但是这个草图的价值还需要你进行注释后才能显现出来。有可能你和诺贝尔奖就差一个注释的基因组。

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基因注释的重要性

从案例中学习套路

陆地棉基因组注释

文章标题为“Sequencing of allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum L. acc. TM-1) provides a resource for fiber improvement”.

同源注释：从Phytozome上下载了7个植物的基因组蛋白序列(Arabidopsis thaliana, Carica papaya, Glycine max, G. raimondii, Populus trichocarpa, Theobroma cacao and Vitis vinifera), 使用 TblastN 将蛋白序列比对到组装序列上，E-value的阈值为1e-5. 将不同蛋白的BLAST的hits用 Solar 软件进行合并。GeneWise 根据每个BLAST hit的对应基因区域预测完整的基因结构。

从头预测：先得构建repeat-mask genome，在这个基础上就用 August, Genescan, GlimmerHMM, Geneid 和 SNAP 预测编码区

转录组预测：用Tophat将RNA-seq数据比对到组装序列上，然后用cufflinks组装转录本形成基因模型。

综上，使用 EvidenceModeler(EVM) 将上面的结果组装成非冗余的基因结构。进一步根据Cscore > 0.5，peptide coverage > 0.5 和CDS overlaping with TE进行筛选。还有过滤掉超过30%编码区被Pfam或Interprot TE domain的注释的基因模型。

这些基因模型使用BLASTP进行功能注释，所用数据库为SWiss-Prot和TrEMBL.蛋白功能使用InterProScan和HMMER注释，数据库为InterPro和Pfam。GO注释则是直接雇佣InterPro和Pfam注释得到的对应entry。通路注释使用KEGG数据库。

Cardamine hirsuta基因组注释

文章标题为“The Cardamine hirsuta genome offers insight into the evolution of morphological diversity”。

同源注释：使用 GenomeThreader 以拟南芥为剪切模型，以及PlantsGDB resourc上 Brassica rapa (v1.1), A. thaliana(TAIR10), A. lyrata (v6), tomato (v3.6), poplar (v2) 和 A. thaliana (version PUT-169), B. napus (version PUT-172) EST assemblies 的完整的代表性蛋白集。

转录本预测：将 C. hirsuta RNA-seq数据比对到基因序列，然后用cufflinks拼接

从头预测：转录本预测得到的潜在蛋白编码转录本使用网页工具 ORFpredictor 进行预测，同时用 blastx 和 A. thalina 进行比较，选择90%序列相似度和最高5%长度差异的部分从而保证保留完整的编码框(有启动子和终止子)。这些基因模型根据相互之间的相似度和重叠度进行聚类，高度相似(>95)从聚类中剔除，保证非冗余训练集。为了训练gene finder, 它们选随机选取了2000个位点，20%是单个外显子基因。从头预测工具为 August , GlimmerHMM, Geneid 和 SNAP . 此外还用了Fgenesh+, 以双子叶特异矩阵为参数进行预测。

最后使用JIGSAW算法根据以上结果进行训练，随后再次用JIGSAW对每个基因模型计算统计学权重。

可变剪切模型则是基于苗、叶、花和果实的RNA-seq比对组装结果。

GO注释使用AHRD流程

小结

举的2个例子都是植物，主要是植物基因组不仅是组装，注释都是一大难题。因为植物基因组有大量的重复区，假基因，还有很多新的蛋白编码基因和非编码基因，比如说玉米基因组80%以上都是重复区域。然后当我检索这两篇文章所用工具的时候，我不经意或者说不可避免就遇到了这个网站 http://www.plantgdb.org/ , 一个整合植物基因组学工具和资源的网站，但是这个网站似乎2年没有更新了。当然这个网站也挺不错,http://bioservices.usd.edu/gsap.html, 他给出了一套完整的注释流程以及每一步的输入和输出情况。

此外，2017年在《Briefings in Bioinformatics》发表的"Plant genome and transcriptome annotations: from misconceptions to simple solution" 则是从五个角度对植物基因组注释做了很完整的总结

植物科学的常见本体
功能注释的常用数据库和资源
已注释的植物基因组意味着什么
一个自动化注释流程
一个参考流程图，用来说明使用公用数据库注释植物基因组/转录组的常规步骤

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注释流程图

以上，通过套路我们对整个基因组注释有一个大概的了解，后续就需要通过实际操作来理解细节。

基因组注释

当我们谈到基因注释的时候，我们通常认为注释是指“对基因功能的描述”，比如说A基因在细胞的那个部分，通过招募B来调控C，从而引起病变。但是基因结构也是注释的一种形式，而且是先决条件，也就是在看似随机的ATCG的碱基排列中找到特殊的部分，而这些特殊的区域有着不一样的功能。

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gene structure

在正式启动基因组注释项目之前，需要先检查组装是否合格，比如contig N50的长度是否大于基因的平均长度，使用BUSCO/CEGMA检查基因的完整性，如果不满足要求，可能输出结果中大部分的contig中都不存在一个完整的基因结构。当组装得到的contig符合要求时，就可以开始基因组注释环节，这一步分为三步：基因结构预测，基因功能注释，可视化和质控。

基因组结构注释

基因结构注释应是功能注释的先决条件，完整的真核生物基因组注释流程需要如下步骤：

必要的基因组重复序列屏蔽
从头寻找基因, 可用工具为: GeneMarkHMM, FGENESH, Augustus, SNAP, GlimmerHMM, Genscan
同源蛋白预测, 内含子分析: GeneWIse, Exonerate, GenomeThreader
将EST序列，全长cDNA序列和Trinity/Cufflinks/Stringtie组装的转录组和基因组联配
如果第4步用到了多个数据来源，使用PASA基于重叠情况进行联配
使用EvidenceModler根据上述结果进行整合
使用PASA更新EVM的一致性预测，增加UTR注释和可变剪切注释
必要的人工检查

基本上是套路化的分析流程，也就有一些工具通过整合几步开发了流程管理工具，比如说BRAKER结合了GeneMark和Augustus，MAKER2整合了SNAP,Exonerate，虽然BRAKER说自己的效果比MAKER2好，但是用的人似乎不多，根据web of knowledge统计，两者的引用率分别是44,283, 当然BRAKER是2016，MAKER2是2011，后者在时间上有优势。

这里准备先按部就班的按照流程进行注释，所用的数据是 Cardamine hirsuta , 数据下载方式如下

# Cardamine hirsutat基因组数据
mkdir chi_annotation && cd chi_annotation
wget http://chi.mpipz.mpg.de/download/sequences/chi_v1.fa
cat chi_v1.fa | tr 'atcg' 'ATCG' > chi_unmasked.fa
# 注释结果
wget http://chi.mpipz.mpg.de/download/annotations/carhr38.gff
# Cardamine hirsutat转录组数据
mkdir rna-seq && cd rna-seq
wget -4 -q -A '*.fastq.gz' -np -nd -r 2 http://chi.mpipz.mpg.de/download/fruit_rnaseq/cardamine_hirsuta/ &
wget -4 -q -A '*.fastq.gz' -np -nd -r 2 http://chi.mpipz.mpg.de/download/leaf_rnaseq/cardamine_hirsuta/ &

软件安装不在正文中出现，会放在附录中，除了某些特别复杂的软件。

01-重复序列屏蔽

重复屏蔽：真核生物的基因组存在大量的重复序列，植物基因组的重复序列甚至可以高达80%。尽管重复序列对维持染色体的空间结构、基因的表达调控、遗传重组等都具有重要作用，但是却会导致BLAST的结果出现大量假阳性，增加基因结构的预测的计算压力甚至影响注释正确性。基因组中的重复按照序列特征可以分为两类：串联重复(tandem repeats)和散在重复(interspersed repeats).

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人类中的重复序列划分

鉴定基因组重复区域的方法有两种：一种基于文库(library)的同源(homology)方法，该文库收集了其他物种的某一种重复的一致性序列，通过相似性来鉴定重复；另一种是从头预测(de novo)，将序列和自己比较或者是高频K-mer来鉴定重复。

目前重复序列注释主要软件就是RepeatMasker和RepeatModel。这里要注意分析的fasta的ID不能过长，不然会报错。如果序列ID过长可以使用bioawk进行转换，后续用到RepatModel不支持多行存放序列的fasta格式。

直接使用同源注释工具RepeatMasker寻找重复序列：

mkdir 00-RepeatMask
~/opt/biosoft/RepeatMasker/RepeatMasker -e ncbi -species arabidopsis -pa 40 -gff -dir 00-RepeatMask/ chi_unmasked.fa
# -e ncbi
# -species 选择物种 用~/opt/biosoft/RepeatMasker/util/queryRepeatDatabase.pl -tree 了解
# -lib 增加额外数据库,
# -pa 并行计算
# -gff 输出gff注释
# -dir 输出路径
# annotation with the library produced by RepeatModel

输出结果中主要关注如下三个(其中xxx表示一类文件名)

xxx.fa.masked, 将重复序列用N代替
xxx.fa.out.gff, 以gff2形式存放重复序列出现的位置
xxx.fa.tbl, 该文件记录着分类信息

cat 00-RepeatMask/chi_unmasked.fa.tbl
==================================================
file name: chi_unmasked.fa
sequences:           624
total length:  198654690 bp  (191241357 bp excl N/X-runs)
GC level:         35.24 %
bases masked:   35410625 bp ( 17.83 %)
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