中国科学技术大学研究生免疫学技术原理与应用复习资料及历年题

中科大-免疫学技术原理与应用

主要由sunrui老师授课，下面分享下复习资料及前两年的考试题作为参考：
2020 的 研究生《免疫学技术原理与应用》教学计划
周次 教学时间 序号 教学内容
2 2020-09-25 1 免疫学技术的发展史、概论及课程介绍
3 2020-10-02 国庆节放假
4 2020-10-09 2 抗体的制备
5 2020-10-16 3 免疫标记技术
6 2020-10-23 4 免疫组织化学技术
7 2020-10-30 5 免疫蛋白质检测技术
8 2020-11-06 6 信号分子检测技术
9 2020-11-13 7 淋巴细胞分离、纯化、清除及 BM 嵌合模型
10 2020-11-20 8 活性染料(vital dyes)细胞示踪技术
11 2020-11-27 9 细胞因子检测技术
12 2020-12-04 10 淋巴细胞功能检测技术
13 2020-12-11 11 淋巴细胞功能研究方法
14 2020-12-18 12 免疫学实验设计
15 2020-12-25 13 实验结果分析
16 2021-01-01 元旦放假
17 2021-01-08 14 实验记录写作与整理
18 2021-01-15 15 科研道德伦理案例分析
19 2021-01- 考试
预修要求：免疫生物学或免疫学

包括每节课（概括时）的拍照：

备注：由于文字不容易排版，资源连同往年题传至资源
免疫技术原理与应用简答题
指出paper2题目中的实验三要素
实验因素：dectin-1
实验对象：Macrophages
实验效应：pancreatic carcinoma and peritumoral immune-tolerance
实验设计的三要素、六原则
三要素：实验对象 实验因素 实验效应
六原则：随机原则 对照原则 重复原则 平衡原则 弹性原则 最经济原则
实验记录相关
实验记录意义：
1）实验记录及其培训是研究生素质教育的基本内容
2）实验记录及其培训是提高研究生科研能力的保障
3）实验记录是保证学术规范的关键
实验记录的基本内容：
1）实验记录的目录：若使用实验记录本，可在开头几页写内容目录，随着实验进程对其进行补充，目录应该包括每个实验的试验编号、精短题目和结果、页码和日期
2）试验编号：最简短的代号码
3）实验名称
4）实验目的：简短的实验动机概要
5）实验准备的所有相关信息：如果是首次使用某种成分或方法，应对其做详细描述
6）实验所用材料：试剂名称、浓度、配制方法、使用仪器名称和状态、细胞株、菌株、质粒来源及保存
7）实验地点
8）实际完成的一系列工作：在整个过程中的任何变化、所得到的任何正常的或者不寻常的观察结果等均应如实记录，即便在出现了很多错误的情况下，记录下实际发生的事情才能使我们解释实验成为可能
9）实验结果及整理：包含收集到的原始数据及实验结果的整理
10）出现问题讨论：出现问题应分析可能原因及解决的办法
11）小结：简短的实验结果总结和解释
根据fig.1内容阐述整体实验的设计思路
问题提出：dectin-1信号与PDA具有相关性，进行两种PDA模型的建立（KC鼠及KPC鼠）来研究
实验思路：根据推测，dectin-1应该在PDA浸润的胰腺中高表达，并且需要确定高表达dectin-1的具体细胞类型，并且根据之前数据，用已知的dectin-1配体进行肿瘤生长的观察
实验设计：在每个独立实验都需要清晰正确的control设定
结果记录并得出结论：根据原始染色图或流式细胞图，需要制定统计图直观得出结论
每一个独立结果的实验设计（包括对照设计）
a:为了观察dectin-1是否在KC鼠的胰腺中表达，用免疫组化方法进行染色观察，并用Clec7a-的KC小鼠作为negative control，为了确定阳性细胞结果；
b:为了确定dectin-1表达的细胞类群，用流式细胞术分别检测PDA浸润的巨噬细胞、mono和DC细胞中dectin-1表达情况，以同型抗体对照检测自发荧光，并用PDA浸润的脾脏以及WT鼠中的脾脏作为对照，用来消除PDA本身以及脾脏本身带来的荧光背景；
c:在KPC肿瘤原位移植鼠中，在上述三种细胞中检测dectin-1的表达，同样以同型抗体对照检测自发荧光，用同鼠的spleen作为对照，比较PDA浸润与否的dectin-1表达差异；
d:为了证明dectin-1在PDA中高表达，分别在正常胰腺巨噬细胞和PDA浸润的巨噬细胞中检测dectin-1的表达，以正常巨噬细胞作为对照，证明确实是PDA导致dectin-1的高表达；
e:在人类PDA模型中检测dectin-1表达的细胞类群，以相同的PBMC来源的 CD14+, CD15+ and CD11c+ 细胞作对照，证明dectin-1只在PDA中表达dectin-1，而在其他情况下不大量表达；
f:为了验证dectin-1 ligation与肿瘤发生的相互关系，分别用d-zymosan、HKCA处理KC鼠，以不做处理的小鼠作对照，从f的免疫组化原始图对正常巨噬细胞、ADM、级别PanIN病变（g），纤维化的胰腺（h）以及正常的腺泡结构（i）所占比例进行统计，以未处理的KC鼠做control；
j:为了直观验证dectin-1 ligation与肿瘤发生的相关性，对原位KPC肿瘤移植的WT鼠进行d-zymosan、HKCA注射给药，以赋形剂给药作为对照，排除除d-zymosan、HKCA外其他成分对肿瘤生长的影响。
阐述这些实验之间的逻辑关系
为了验证dectin-1信号与PDA之间的相关性，首先要观察dectin-1是否在KC鼠的胰腺组织中高表达（a），接下来，需要确定dectin-1表达的具体细胞类型，并在KPC肿瘤模型中进一步验证（b,c），之后，进一步验证dectin-1是否在PDA浸润的胰腺中高表达（d），并在人类PDA模型中验证dectin-1的表达是PDA特异的（e）。确定dectin-1在PDA浸润的胰腺免疫细胞中高表达之后，作者想进一步听过dectin-1的ligation作用验证dectin-1促肿瘤的方式（f-i），发现用dectin-1的配体刺激KC鼠后，其胰腺发生病变严重，进一步测量肿瘤的重量证明dectin-1 ligation确实加速肿瘤的生长。
对fig.1的结果进行描述并得出的结论
Fig.1的a-e都从各个方面进行dectin-1在PDA中高表达的验证，确定dectin-1确实在PDA免疫细胞高表达且PDA特异，f-j通过dectin-1 ligation实验证明，dectin-1 ligation确实会使PDA肿瘤细胞发生病变且加速肿瘤生长速度，得出的结论：dectin-1在小鼠或人类PDA中高表达且dectin-1 ligation促进肿瘤发生。
Fig.2整体研究思路：
问题提出：为了研究dectin-1信号对胰腺肿瘤发生的正常进展是否是必需的
实验现象观察：免疫组化观察在dectin-1缺失的KC鼠胰腺中腺泡结构所占比例与纤维化比例
实验设计：通过对一些蛋白表达的检测以及之前得到证实的p-syk含量进行检测，用syk的抑制剂处理小鼠进行肿瘤生长的测量
实验结果：dectin-1激活下游信号进而调控肿瘤发生
对Fig.2每个独立结果进行描述及实验设计
a：利用免疫组化的H&E染色dectin-1+和dectin-1-的KC鼠胰腺组织，并对胰腺组织中ADM、正常、和级别的PanIN病变导管结构所占的比例进行统计并作柱状图比较，以dectin-1未缺失鼠的胰腺做对比，证明dectin-1对这些结构的作用，结果显示：dectin-1缺失时，完整腺泡结构显著增加，且病变导管结构显著减少（在3mouth、6mouth、9mouth相同结果）
b:对小鼠生存时间进行观察统计，发现dectin-1缺失的KC小鼠生存期显著延长
c:对KC小鼠胰腺裂解液进行成分检测，结果显示：dectin-1缺失鼠中高表达Bcl-xL、Rb,Smad4和p16，但是低表达p53和c-myc（癌症发生的标志）
d:用syk的抑制剂处理dectin-1+、dectin-1- KC小鼠，并用vehicle对照排除其他成分的影响，然后对小鼠胰腺重量进行测定，结果显示：在dectin-1存在的KC小鼠用syk抑制剂处理后，胰腺重量显著减少，但是在dectin-1缺失鼠中无此现象，证明dectin-1与syk在影响PDA发生时属于同一通路。
e:在KPC原位肿瘤模型中进行syk抑制剂给药，并用流式细胞术进行p-syk表达量的检测，结果显示：用抑制剂处理后的PDA浸润的APCs中p-syk含量表达显著降低
对fig.2结果之间的逻辑关系进行阐述以及最后得出的结论
为了研究dectin-1信号传导是否对于肿瘤发生是必需的，首先在KC胰腺组织中观察dectin-1的存在与否是否对胰腺结构产生影响（a）及小鼠存活与dectin-1的关系（b），在验证了dectin-1缺失确实会对KC小鼠胰腺有保护作用之后，接下来在分子层面进行检测（c），比较dectin-1缺失会引起哪些蛋白的异常表达。由于之前已经验证dectin-1会激活下游的syk，产生大量的p-syk，作者推测当用syk的抑制剂处理KC小鼠后，会防止胰腺癌的发生，便对KC鼠胰腺重量进行检测（d），并且p-syk含量测定也直观证实抑制剂缺失抑制了syk的活化（e）。所以，通过上述结果，我们可以得出结论：dectin-1在PDA肿瘤发生中起至关重要的作用，且可通过阻断dectin-1下游的信号传导（如p-syk激活）进行肿瘤治疗。
Fig.3中用了哪些免疫学实验，简述其原理：流式细胞术
1）对每一个独立结果进行描述
Fig.3a、b通过流式细胞技术对CD4+T细胞表达ICOS进行检测，在活化的T细胞中，ICOS表达量应该升高，以未染色的negative control作为对照，对其他实验组进行设门，αCD3/CD28作为positive control，发现在肿瘤浸润的WT CD11b+ Mᴓ会抵消T细胞活化导致的ICOS上调，而dectin-1缺失会对此现象有抑制作用，fig.3 c,d，检测活化T细胞中CD44+CD62-的表达情况，以未染色的细胞作为对照划分4个象限，计算CD44+ CD62-细胞所占的比例，以αCD3/CD28作为positive control，发现在肿瘤浸润的WT CD11b+ Mᴓ会阻止活化的T细胞向效应记忆细胞的转化，而dectin-1的缺失也对此现象有抑制效果。Fig.3 e,f，检测活化的CD4+T细胞中IL-10的表达和CD8+T细胞细胞毒性检测，以未染色的negative control进行设门，统计表达IL-10的细胞比例，结果显示，肿瘤浸润的WT CD11b+ Mᴓ促进CD4 T细胞产生IL-10，在dectin-1缺失时无促进作用，而在CD8 T细胞中，dectin-1缺失的肿瘤浸润的Mᴓ会促进T细胞毒活性。
2）简述这些实验之间的逻辑关系
作者推测dectin-1缺失可能会导致PDA浸润的T细胞免疫抑制的表型逆转，在体外进行此项验证，首先用CD3/CD28刺激CD4和CD8活化，之后用流式细胞术检测T细胞内细胞因子的表达，ICOS、IFN-r、TNF-α在活化的T细胞中表达量会升高，而IL-10在活化的T细胞中表达量会降低，所以作者首先在PDA浸润的活化后的CD4（a）和CD8（b）中检测ICOS的表达，发现肿瘤浸润的WT 巨噬细胞会抵消T细胞活化导致的ICOS的上调，而在dectin-1缺失时被回复；之后，验证了CD4（c）和CD8（d）中CD44+ CD62L-的细胞比例，相似的，肿瘤浸润的WT CD11b+ Mᴓ会阻止活化的T细胞向效应记忆细胞转化，之后在活化的CD4+T细胞中，发现肿瘤浸润的WT CD11b+细胞会促进IL-10的产生（e），以及CD8+T细胞中低表达的IFN-r、TNF-α（f）,而在dectin-1缺失时这种现象得到回补。
3）该组实验得出的结论
由作者开始的推测：dectin-1缺失可能会导致PDA浸润的T细胞免疫抑制的表型逆转，进而设计了一系列实验验证在dectin-1存在的PDA浸润的活化T细胞中相关细胞因子的表达，发现在所有dectin-1存在的PDA浸润的T细胞都发生表达异常，而在dectin-1缺失时表型得到回补，所以，该组实验证明：PDA浸润CD11b+Mᴓ抑制T细胞的活化，而dectin-1缺失PDA浸润的CD11b+Mᴓ无抑制T细胞的功能。
对Fig.3 Sfig.5(a b c) Fig.4整体研究思路（特别是逻辑关系）进行描述，并对整体结果进行阐述，结论是什么
作者主要想寻找dectin-1作用于TAM的作用机制，在fig.3中，证明小鼠dectin-1PDA浸润的巨噬细胞存在对T细胞抑制功能的消减作用，即PDA浸润CD11b+Mᴓ抑制T细胞的活化，而dectin-1缺失PDA浸润的CD11b+Mᴓ无抑制T细胞的功能，之后Sfig.5a,b中体外纯化的TAM中也证实WT-CD11b+ TAMs抑制TC活化产生CKs的能力，而为了验证是否在所有免疫细胞中都会有此现象，作者在Sfig.5c中证明，CD11b+Neu/Mono并不会影响TC活化产生CKs的能力，这就表明只有TAM中的dectin-1信号传导会影响TC的功能。在体外实验验证成功之后，作者希望在体内验证dectin-1的信号是否会在PDA原位促进巨噬细胞介导的免疫抑制，fig.4a,b免疫组化图证明dectin-1缺失会显著降低KC鼠PDA浸润TAMs，c和d的流式细胞术也分别证明在dectin-1缺失的自发肿瘤模型和原位肿瘤模型的胰腺TAM比例降低，由于之前已经证明dectin-1缺失宿主肿瘤中，多种炎症介质的表达降低，而通过fig.4e-g中TAM浸润的dectin-1缺失胰腺高表达MHCII，低表达CD206、高表达TNF-α和iNOS证明，dectin-1缺失会诱导TAM向MI类巨噬细胞分化；之后作者证明用dectin-1激动剂d-zymosan给药可在PDA TME中检测高表达的p-syk，并且在原位KPC肿瘤鼠dectin-1激动剂处理后，胰腺中浸润的TAM比例升高且TAM高表达CD206，MHCII表达无变化，进一步的原位转输实验，即用原位KPC移植的dectin-1缺失鼠中移入WT和dentin-1缺失的巨噬细胞，侧向肿瘤的体积结果证明：dectin-1缺失的巨噬细胞会抑制肿瘤的生长。所以通过这一系列实验我们可以得出结论：dectin-1缺失会诱导肿瘤浸润的巨噬细胞的免疫原型重编程，进行肿瘤抑制。
对Sfig.4的整体研究思路进行阐述，并对整体结果进行描述，结论是什么（如何排除是上皮细胞而证明只有髓系来源的白细胞dectin-1缺失具有保护抗PDA作用）
作者为了探究dectin-1与配体结合之后是否会对转化的胰腺上皮细胞有直接的促进生长和激活作用，用了dectin-1的激动剂体外处理KPC鼠肿瘤细胞，分别检测上皮细胞的增殖与MCP-1、IL-10等细胞因子的产生（Sfig.4a-c），结果证明，dectin-1与配体的结合不能诱导PDA转化上皮细胞活化；为了进一步验证dectin-1 ligation是否对PDA细胞有直接的致癌或者促炎作用，用shRNA使KPC鼠肿瘤细胞的dectin-1表达沉默（d），但是e图结果显示dectin-1的knockdown并没有改变肿瘤细胞生长，并且相似的结果也在KC鼠中获得（f,g），证明，在转化的上皮室中的dectin-1信号传导对PDA的调节不是关键的；既然在转化的上皮室中dectin-1信号对PDA的调节不是关键的，所以作者推测dectin-1在单独的上皮外隔室缺失可能会对PDA有抵抗作用，原位KPC肿瘤细胞注射实验（h）以及小鼠存活时间（ｉ）证明，KPC肿瘤细胞在dectin-1缺失鼠的胰腺生长显著抑制，提示dectin-1缺失保护抗PDA的dectin-1信号来自于肿瘤细胞外的成分，为了进一步确定这种dectin-１缺失保护作用的确定来源，作者构建了KC鼠与dectin-1缺失鼠的骨髓嵌合模型，并对导管中成分及病变情况分析，结果显示，dectin-1缺失骨髓保护抗瘤形成，从而证明只有髓系来源的白细胞缺失dectin-1具有保护作用。从上述内容，我们可以得出结论：在转化上皮细胞的dectin-1缺失无抗PDA的保护作用，只有髓系来源的白细胞dectin-1缺失才会有保护作用，也证明了dectin-1的作用细胞是髓系来源的白细胞。
2）其中最重要的实验是哪些并说明理由
最关键的实验有两个：1）是在转化上皮细胞中基因沉默dectin-1的表达，证明dectin-1作用的细胞并不是转化的上皮细胞。从这个实验作者推测，dectin-1作用的细胞可能是单独的上皮外隔室，从而进一步开展了第二个关键实验2）骨髓嵌合模型鼠的构建，分别构建KC；WT骨髓以及KC；dectin-1骨髓，证明只有髓系来源的白细胞dectin-1缺失具有保护抗PDA的作用，从而找到dectin-1作用的细胞类别。

免疫组化技术概念：

简述Fig.4a&b的实验原理：
由图中结果可知，这两幅图是根据免疫组化的结果得出的，左边为免疫组化的原始图，右图为统计结果。a、b图为两种小鼠模型中F4/80、Arg1含量的差异比较：在进行免疫组化时，分别用F4/80和Arg1的抗体孵育后，加入特异性二抗，孵育30min后，加显色底物进行显色，之后经过复染、脱水透明、封片等步骤，在40X物镜下显微成像，每张载玻片拍摄10个视野，并进行结果的统计与分析。
由免疫组化原始成像图左下角展示的同型对照图可以看出，左图阳性着色较强，分别计算两种切片下的阳性细胞的数量，随机取十个视野进行计数，最好是由不同的同学以相同的标准进行计数，然后对十个视野下的阳性细胞数量取平均值，得到右边的统计图。

得出结论：KC鼠中，在PDA背景下，dectin-1的缺失使小鼠体内F4/80和Arg1数量显著减少，可以得出结论，KC鼠中，dectin-1缺失会显著减少PDA浸润的巨噬细胞。
在c图中，用流式细胞术检测KC鼠dectin-1存在与缺失时， 肿瘤浸润的CD11c−Gr1−CD11b+F4/80+ 巨噬细胞数量，结果显示在dectin-1缺失的KC鼠中，肿瘤微环境中巨噬细胞有50%的减少；并且d图结果显示，原位移植的KPC肿瘤模型与WT小鼠相比，肿瘤微环境的巨噬细胞也会出现相似的下降。
接下来，作者对PDA浸润下的巨噬细胞中成分进行流式细胞检测，发现在dectin-1缺失的KC鼠巨噬细胞中高表达MHCII（e），低表达CD206（f）并且高表达TNF-α和iNOS（g），这些结果表明TAMs进行了重编程，向M1类细胞分化。
给小鼠进行dectin-1配体d-zymosan给药刺激，并检测PDA浸润的巨噬细胞中p-syk的表达量，以空白给药（vesicle）作为对照，h结果显示，d-zymosan确实可以在PDA的肿瘤微环境下刺激syk信号，在给药后的21天，对原位KPC肿瘤模型中检测TAMs的含量，i结果显示，dectin-1的ligation确实显著增加TAMs，并且TAMs中的CD206显著上调（j），但是MHCII含量并没有显著改变（k），过继转输实验（在dectin-1缺失鼠中原位移植KPC鼠来源的PDA，之后在此基础上，分别加入WT鼠的巨噬细胞和dectin-1缺失鼠的巨噬细胞），之后对肿瘤体积进行监测，l结果显示，来源于dectin-1缺失鼠的巨噬细胞鼠显著抑制肿瘤生长。
简述Sfig.1a.b.c.d原理，并对结果进行描述：
在a、b图中，研究模型为KC鼠，用免疫组化染色技术对KC鼠胰腺中白细胞以及转化的上皮细胞进行dectin-1表达含量的测定，在两种组织中，分别用了anti-dectin1、anti-CD45和anti-dectin1、anti-CK19抗体孵育，之后与DAPI进行共染色，DAPI可将细胞核染成蓝色，CD45和CK19分别作为小鼠白细胞和上皮细胞的marker显红色，而dectin-1显绿色，以KC鼠与dectin-1缺失鼠杂交得到的KC；dectin-1鼠为negative control，证明在KC鼠中，胰腺白细胞和转化上皮细胞高表达dectin-1。
根据Fig.5及Sfig.6实验结果阐述
1）整体研究思路
研究思路：提出假设：dectin-1缺失导致的TAM重编程可能会致使肿瘤夹带的T细胞免疫原性的提高 设计实验根据细胞因子的表达验证KC鼠胰腺中CD8+和CD4+T细胞的表型 进而验证dectin-1与T细胞免疫原性升高之间的相互依赖关系 反向利用dectin-1激动剂来证明dectin-1 ligation会降低T细胞免疫原性 通过T细胞耗竭实验直接验证dectin-1缺失的抗肿瘤作用与T细胞的依赖关系 得出结论
2）每一个独立实验结果描述及逻辑关系并说明整体结果与结论
为了验证作者提出的假设，作者首先在KC鼠胰腺中观察dectin-1缺失与否时T细胞发生的变化，fig.5a-c流式细胞结果图显示在dectin-1缺失的KC鼠胰腺肿瘤引流的CD4+和CD8+T细胞都上调CD44、OX40和PD-1的表达，证明dectin-1缺失确实会引起T细胞的免疫原性重编程，fig.5d证明dectin-1缺失的KC鼠肿瘤引流淋巴结CD8:CD4比例升高，证明细胞毒性增强，e图的PKC原位肿瘤鼠肿瘤浸润T细胞也出现相同结果，接下来，fig.5f图结果显示PKC原位肿瘤浸润的CD8T细胞在dectin-1缺失时表现PD-1、T-bet、TNF-α及Granzyme B表达上调，说明CD8被活化，细胞毒功能增加，fig.5g图表明PKC原位肿瘤浸润的CD4T细胞在dectin-1缺失时表现CD44、CD107a和ICOS高表达，以及T-bet、TNF-α的高表达，说明Th1细胞极化增强。这些数据都表明T细胞的免疫原性增强，另外，为了验证dectin-1缺失与T细胞免疫原性之间的相互依赖关系，将dectin-1缺失与PD-1阻断联合给药（fig.5 h,i），结果显示dectin-1缺失与PD-1阻断有协同抗肿瘤作用，提高了瘤内T细胞向Th1的极化，而在dectin-1存在的情况下PD-1阻断没有效力。上述实验证明dectin-1缺失确实会使T细胞免疫原性增强，接下来作者通过dectin-1的激动剂处理KPC来源的肿瘤细胞进行侧面验证dectin-1的ligation会抑制T细胞的活化，S6a证明dectin-1与对照组相比，激动剂处理的KPC荷瘤小鼠表现为肿瘤浸润的CD4+T细胞T-bet、TNF-α表达降低，IL-5、IL-10和IL-13表达升高，而S6b也证明肿瘤浸润的CD8T细胞，激动剂处理后表现T-bet、TNF-α表达降低，进一步的巨噬细胞耗竭实验（S6c,d）证明，PKC荷瘤的WT鼠体内巨噬细胞清除活化PDA浸润的CD4、CD8T细胞而在dectin-1缺失鼠中无此现象，提示在PDA dectin-1在巨噬细胞中的表达导致了T细胞的抑制。接下来，为了明确检测dectin-1缺失的抗肿瘤作用是否直接取决于免疫原性T细胞的重编程，作者分别在WT和dectin-1鼠中原位KPC肿瘤中进行了T细胞清除实验，S6e结果显示，T细胞的清除对WT鼠中PDA生长无作用，但是在dectin-1缺失鼠中抵消了抗肿瘤作用，S6f,g图展示了CD4+和CD8+T细胞单独清除时均可逆转dectin-1缺失鼠中肿瘤保护效用，但在WT鼠中无此作用，结果提示，在WT荷PDA小鼠中T细胞可有可无，但是在dectin-1缺失时，必须要通过T细胞的重编程才能起始对肿瘤的保护作用。
通过上述结果描述，我们可以进行结果的总结，fig.5主要说明PDA下，dectin-1缺失会诱导T细胞发生免疫原性重编程，提高免疫原性及细胞毒功能，之后在S6中，从侧面（dectin-1激动剂给药）和正面（T细胞清除）验证dectin-1 ligation会抑制T细胞功能，并且dectin-1缺失的肿瘤保护作用是完全依赖于T细胞的免疫原性重编程的。最后的结论是：PDA中dectin-1信号抑制T细胞免疫原性来促进肿瘤生长。
在肿瘤微环境中T细胞往往处于被抑制状态，若想知道可能抑制T细胞功能的因素，如何研究？
首先构建两种实验模型：原位肿瘤移植小鼠与WT小鼠，接下来通过流式细胞术对肿瘤部位的细胞进行分析，1）确定TME是否会分化出其他不同于WT的细胞类群（如Treg细胞群增多等）或者Th1细胞极化减少，2）再通过检测一些T细胞活化会表达（或会上调/下调）的细胞因子及毒力因子等表达量与WT对比，可以确定TME中T细胞的表型，确实处于被抑制的状态，之后确定某些因子确实表达差异后，进行认为给药注射到TME中，对肿瘤重量进行测量，观察人为给药是否可以回补T细胞抑制作用，3）并在给药后进行TME中PH或者溶氧状态进行测定从而进一步确定抑制T细胞功能的因素。

免疫组学内容：

为何Sfig.2a中使用的是pull-down（precipitation）而不是IP，简述两种方法的原理与用途？
1）在Sfig.2中，作者的主要研究目的是为了观察在dectin-1与配体结合后，会激活哪些下游途径，所以，在此例中，主要研究的是一种已知蛋白与其他未知蛋白的相互作用。
2）pull-down实验原理：将已知待研究蛋白构建一种融合蛋白的形式，在本文中以dectin-1 Fc形式，将融合蛋白预先固定于特异性的beads上，当细胞抽提液经过该混合物基质时，与该固定蛋白相互作用的配体将会被吸附，达到沉淀的目的。而IP实验原理：利用抗原抗体特异结合原理，将某一种抗体预先与beads孵育，之后将含有两种蛋白质的融合体细胞裂解液与上述抗体-beads混合物进行孵育，使其中一种蛋白质与抗体特异结合从而被吸附到beads上，之后，用另一种蛋白的特异抗体进行WB检测，如果能曝出相应蛋白，则证明两者有相互作用，但是这种相互作用可能并不是直接的，可能会存在中间介质介导。pull-down实验可以用于一种已知蛋白与未知蛋白的相互作用和两个已知蛋白之间的相互作用，而IP实验通常用来检测两个已知蛋白间相互作用。所以在Sfig.2中研究未知蛋白时选用的是pull-down实验。
简述Sfig.2和fig.6中所用到的实验及原理，并对结果进行描述
在Sfig.2 a图所用实验为pull-down技术，检测dectin-1融合蛋白是否在两种小鼠模型中表达，根据实验结果，我们可知，在年龄相当的WT和KC鼠中，只有KC鼠会表达dectin-1 Fc融合蛋白，可推测，在KC鼠胰腺中，dectin-1的配体确实存在，而在WT鼠中没有此配体；
D图所用的是免疫组化染色技术，DAPI将核染成蓝色，黄色CD68标记的肿瘤组织以及红色标记的dectin-1 Fc融合蛋白，可以得出结论，在KC鼠PDA肿瘤组织中，确实存在dectin-1的配体；
E,f,g,h,i五幅图所用的实验技术为流式细胞分析，其基本原理为：染色的细胞样品通过流式细胞仪时，由于鞘液的作用被限制在液流的轴线上，从而通过一个非常小的喷嘴。这个微小的流液束使细胞一个接一个地通过激光，细胞／粒子通过通道时散射的光线被多个探测器检测到。其中光柱前有一个检测器（称为前向角散射或简称FSC），它的旁边有几个检测器（称为侧向角散射或简称SSC）。荧光检测器用于检测荧光染料本身。
在这里是检测不同细胞内dectin-1配体的表达，即单细胞内检测细胞因子的表达，其原理为：通过体外多克隆激活剂如PMA和离子霉素或特定的抗原激活细胞，同时用brefeidin A 将细胞因子阻断与内质网内抑制细胞因子向胞外的释放，从而富集细胞因子，使信号增强，之后用CD32/16阻断非特异性结合，用多聚甲醛固定并用皂角苷增加细胞膜通透性，e图用带有荧光anti-dectin 1 Fc、anti-CD11b/MHCII抗体与细胞内特定的细胞因子结合，以KC鼠中脾脏中dectin-1 Fc信号的检测作为negative control，之后将流式细胞图划分为4个象限后，对双阳性细胞比例进行统计得出右图的直方统计图，f图的作用模型是原位KPC肿瘤模型，从e,f图的结果我们可得出结论，dectin1配体在PDA浸润的巨噬细胞和DC中表达。
G,h,I三幅图也是根据流式细胞技术得出的结果，三幅图的作用模型分别是KC鼠上皮细胞、原位KPC肿瘤模型以及体外培养的PDA人类肿瘤模型，以isotype control（同一种属来源的抗体，但不具有结合特异抗原的能力）作为消除抗体非特异性结合发出的背景荧光，检测到阳性的anti-dectin 1Fc的荧光信号与isotype control做对比（i图中以isotype control进行设门），可以得出结论：dectin-1的配体在PDA的转化上皮细胞有表达，并且也表达在体外培养的人类PDA肿瘤模型中。
Fig.6结果描述
a根据流式细胞结果，检测 来自PDA浸润的和脾脏中的Gr1+ CD11b+的neu/mono细胞、巨噬细胞和DC细胞中Galectin-9的表达情况，并根据isotype control来进行设门，得出结论：Galectin-9在PDA浸润的neo/mono、巨噬细胞及DC细胞中都有高表达
b图的原位KPC肿瘤模型结果也证明有Galectin-9的高表达；
c图的流式细胞术分别检测白细胞和肿瘤细胞在PDA浸润下和PBMC中表达情况差异，用带有荧光的anti-Galectin 9抗体进行实验，并用同型IgG抗体做isotype control，根据结果可以得出结论：Gal-9表达在人的PDA浸润的白细胞和肿瘤细胞，而在PBMC中，两种细胞都不表达Gal-9；
d图和e图用免疫组化染色技术，将anti-Gal 9和anti-CD45（白细胞marker）/anti-CK19（转化上皮细胞marker）与DAPI进行共染，用共聚焦显微镜进行成像，并用anti-Gal9的同型抗体作为isotype control，根据图中结果，我们可以得出结论：Gal-9在KPC肿瘤模型中的白细胞和转化上皮细胞中都有所表达；
f图中，先用dectin-1 Fc融合蛋白与磁珠结合后，与重组的Gal-9共孵育，再分别用特异性带有荧光标记的anti-Gal9抗体和同型抗体进行荧光检测，用无染色的荧光作为背景荧光强度，结果显示：dectin-1 Fc融合蛋白快速与Gal-9结合，而其他control则无此现象，之后，在体系中增加了dectin-1的已知配体：d-zymosan后，发现荧光强度变低，说明dectin-1与Gal-9之间的结合会被dectin-1的其他配体竞争抑制；
g,h图结果是根据ELISA实验得出，ELISA原理：Gal-9首先被培养板捕获，之后与dectin-1 IgG Fc/IgG Fc进行孵育，这种dectin 1—Gal 9的复合物会被特异性anti-IgG的二抗进行检测，其中IgG Fc作为negative control，由图中结果我们可得出结论：Gal-9与dectin-1的结合在小鼠或者人类细胞中都以一种剂量依赖的方式；在i图中，分别以Gal-9、Gal-3和Gal-4结合的培养板为基底，进行上述ELISA实验，实验结果证明dectin-1不与Gal-3或Gal-4结合，说明dectin-1与Gal-9的集合是特异的；
j图所用的方法是pull-down，主要为了证明在胰腺组织中是否有dectin-1—Gal 9的复合物的成，以重组的Gal-9作为positive control，结果证明，在组织中确实可以形成dectin 1—Gal 9的复合物；
k图用pull-down来验证dectin-1与Gal-9的结合是否是通过多糖的作用，1,2甬道分别是Gal-9和dectin-1的input，3甬道说明dectin-1和Gal-9在不加其他物质情况下的相互作用情况，作为一个对照，4中加入了PNGaseF(切断N端连接的多糖)，发现两者结合与3相比无差异，5中只加了dectin-1和PNGaseF，发现PNGaseF对dectin-1的表达无影响，并不会有相互作用出现，6中在3的基础上添加了高浓度的Galectins的抑制剂，发现两者的相互作用依然没有差异，所以结果证明，dectin-1与Gal-9的结合不依赖于多糖。
l:为了检测Gal-9是否确实是dectin-1的有功能的配体，我们已经知道dectin-1与配体结合会激活下游的syk信号，通过流式细胞对巨噬细胞中p-syk表达量的检测，结果表明：Gal-9处理后的WT小鼠中p-syk高表达，而在dectin-1缺失鼠中无变化
m:为了验证dectin-1与Gal-9之间的ligation是否是剂量依赖的，对dectin-1的报告细胞HEK293分别用低剂量和高剂量或者不用Gal-9进行处理，并用已经鉴定的dectin-1配体d-zymosan和curdlan处理作为positive control，然后通过检测细胞内分泌的胚胎碱性磷酸酶含量进行定量，结果显示：Gal-9处理的细胞显示与d-zymosan和curdlan处理的细胞相同表型，都以一种剂量依赖的方式与dectin-1相互作用。
对Sfig.2、Stab.1和Fig.6的整体思路及整体结果描述并说明结论
首先根据Sfig.2中内容，我们可知dectin-1的配体确实存在，并且在PDA浸润的巨噬细胞和DC细胞中存在，之后对dectin-1的配体进行确切的定义，用全色谱的方式，筛选出了19个只与dectin-1 Fc结合的蛋白，后来因为Gal-9是凝集素家族成员之一，所以作者假定Gal-9为dectin-1的配体，接下来就要验证gal-9是否与dectin-1一样会在PDA TME中表达，结果证明Gal-9确实在PDA浸润的白细胞和肿瘤细胞中都有所表达，并用显微镜进行直观的观察证实，后来用流式细胞术证实的dectin-1确实会与Gal-9以一种竞争抑制的方式进行结合，并且是特异的结合，接下来想知道两者的结合方式，推测是由多糖介导，但是pull-down实验证明dectin-1与Gal-9的结合与多糖无关。
简述SFig.2中3中方法的原理

请描述Sfig.2b图中是怎样根据免疫组化原始图得到统计图的
根据免疫组化的原理，用p-syk的特异带有显色剂的抗体对两种KC鼠的胰腺细胞进行原位标记，之后用特异二抗孵育30min后，加显色底物进行显色，之后经过复染、脱水透明、封片等步骤，在40X物镜下显微成像，每张载玻片拍摄10个视野，并进行结果的统计与分析。在结果分析时，需要一个同型对照的免疫组化图来确定阳性染色结果，之后在同一张玻片上随机选取10个视野，进行阳性染色细胞的数量统计，并计算平均值，即可得出右图的统计图。
Sfig.2 b、c两幅图中的统计图有什么不同，并对实验结果进行描述
比较两幅统计图我们可以看出，虽然都是在检测p-syk在细胞中的表达情况，但在免疫组化得出的统计图中，纵坐标以每个视野中阳性染色（含有p-syk）的细胞个数来表示，是绝对数值，而在流式细胞术得出的统计图中，是根据isotype control来设门计算阳性结果的比例，是一种相对比值，b图IHC证实KC胰腺PDA组织高表达p-syk，dectin-1缺失的PDA中表达明显降低，证明syk信号通路与dectin-1相关，c图的流式细胞结果证明KC胰腺PDA组织中髓系免疫细胞高表达p-syk。
三种检测细胞信号因子的方法比较
WB FACS IHC
分析群体 多细胞分析 单细胞分析 组织分析
样品 同质样品 可分析异质样品 同质样品
检测范围 单参数 可同时分析多参数 多参数
细胞数量要求 大量细胞用于收集 少量即可分析 对组织中细胞进行数量统计
反应时间 持续时间长达数小时 快速反应且可做多组平行试验 对组织处理时的要求较高
结果分析 根据抗原抗体特异结合原理，依据蛋白大小进行确定，抗体的选择不是蛋白特异而是标签特异的 抗体必须高度选择性且高度特异，对亲和力要求很高，可能需要抗体带有荧光标记 抗体是蛋白特异的并且带有显色剂以便进行染色观察

Sfig.2a,b,c，fig.2d,e，fig4h，fig.6l逻辑分析，说明总体研究思路及结果并得出结论
为了验证dectin-1与配体的结合是否会激活下游一些信号通路，S2a图通过pull-down实验证明，在KC鼠模型中，syk的磷酸化显著提高，证明JNK信号通路被激活，接下来S2b图进一步验证在KC鼠的胰腺中，是否会高表达磷酸化的syk，S2c流式细胞图也证实p-syk也在PDA浸润的髓系细胞中高表达。由于dectin-1通过磷酸化syk进行信号传导，那么作者想进一步验证syk的阻断是否会防止胰腺肿瘤的发生，所以在fig.2d图中，用syk的抑制剂处理KC小鼠（dectin-1+、dectin-1—），并用vehicle处理做对照，测量胰腺的重量，结果表明syk的阻断可降低KC鼠肿瘤生长，右图免疫组化染色证明syk的抑制剂可减轻小鼠胰腺异常改变，但是在dectin-1缺失鼠中无保护作用，并且在e图的KPC原位肿瘤模型中也证明，syk抑制剂能有效在体内阻止syk的活化，在fig.4h图中用一种dectin-1的激动剂处理细胞，流式细胞结果证明，用dectin-1激动剂处理的KC小鼠体内高表达p-syk，证明外源性的dectin-1激动剂可以活化PDA肿瘤微环境syk信号，由于已经证明Gal-9是dectin-1的配体，所以作者想要证明外源的Gal-9是否可以激活syk信号，所以分别用WT、dectin-1缺失鼠进行外源性Gal-9注射，并用流式细胞术进行p-syk表达检测，结果证明，Gal-9对syk信号的激活是dectin-1依赖的。所以，从这几幅图中我们可以得出结论：Gal-9与dectin-1结合后，通过磷酸化下游的syk信号（JNK通路）促进肿瘤发生，而通过syk信号的阻断可延缓这种现象，提示这是一个新的对胰腺癌症发生的治疗方向。