小罗碎碎念
文献日推Day 3&4
本期分享一篇2023年10月2日发表在nature reviews bioengineering的文献——Artificial intelligence for digital and computational pathology。
文献预览
这篇文章讨论了**人工智能（AI）和深度学习在计算病理学领域的进展。作者强调了人工智能在临床诊断自动化、预测患者预后以及从组织图像中发现新生物标记物方面的潜力。他们讨论了阻碍基于人工智能的系统在临床实践和研究中广泛应用的技术障碍。文章总结了计算病理学在方法论方面的最新进展，并对该领域的未来进行了展望**。
文章的关键论点
- **组织切片数字化**和人工智能的进步推动了计算病理学领域的发展。
- 基于人工智能的系统有可能**实现临床诊断自动化、预测患者预后和发现新的生物标记物**。
- 在临床实践和研究中广泛采用基于人工智能的系统仍存在技术障碍。
- 文章总结了计算病理学在预测全切片图像临床终点方面的最新方法学进展。
- 作者对计算病理学未来的发展前景进行了展望，认为**计算病理学可以利用不同模式的临床数据扩展到更广泛的临床和研究任务中**。
主要发现
- 计算病理学中的人工智能可以**预测临床终点**，为病理学家和研究人员提供帮助。
- 组织预处理包括对**组织学切片进行数字化和分割，以去除背景区域**。
- **多实例学习**是从整张切片图像中预测临床终点的一种不断发展的范例。
- 计算病理学可以使病理学家执行的任务自动化，并发现**形态学生物标记物**。
- 要想在临床上采用计算病理学工具，需要更大的、经过精心整理的**多模态数据集**以及人工智能框架的进步。
总之，这篇综述文章概述了将人工智能用于数字和计算病理学的进展和挑战，强调了人工智能对临床实践和研究的潜在影响。
一、引言
随着扫描系统、成像技术和存储设备的进步，临床设施中获取的全切片图像（WSIs）的量不断增加，这些图像可以通过人工智能（AI）和深度学习技术进行计算分析。数字化和自动化临床病理学能够为患者和临床医生提供更客观的诊断和预后，有助于发现新的生物标志物，并能帮助预测对治疗的反应。例如，AI辅助诊断和自动分类技术可以帮助确定癌症的原始部位，对前列腺癌进行分级，预测结直肠癌患者的预后，以及检测乳腺癌中的淋巴结转移。
机构正在收集大量的数字化切片，通过将切片扫描整合到常规工作流程中或通过数字化切片档案来实现。此外，公共项目，如国家癌症研究所的**癌症基因组图谱（TCGA）计划，也支持了不同疾病模型的大样本收集**。计算机存储成本的大幅降低和更强大的处理器的可用性，特别是图形处理单元（GPUs），使得实验室能够基于成千上万的样本进行大规模研究。
在计算机视觉的成功基础上，AI和深度学习的集成已经成为CPath系统的核心算法组成部分。这些发展对于一个从20世纪60年代开始的领域来说是一个巨大的进步，该领域当时的目标是通过对核形态的简单统计分析来转变病理学的临床实践。基于机器学习的前沿工作表明，从ROI区域手工制作的、可解释的特征（HIFs）可以提取出有价值的诊断和预后信息。这些原则现在正在通过深度学习进行扩展，深度学习可以自动识别和从高维输入数据中提取相关的形态学特征。
尽管CPath在减少观察者间变异或减轻病理学家负担方面被视为一个工具，但它还可以**帮助发现新的生物标志物。例如，通过组织分析，AI可以帮助解码不同的生物学现象，并识别出对诊断和预后有意义的新的形态学特征**。
在临床环境中，CPath还可以用于治疗和药物开发，通过自动化识别药物暴露在小鼠和临床试验中的组织标本中的形态学变化。
尽管取得了这些进步，CPath在病理研究和精准医学领域仍有很大的发展空间。特别是**计算机视觉研究的进步不断为CPath算法提供新的方法，例如通过视觉变换器和自监督学习（SSL）进行表征学习。此外，向精准医学的转变需要越来越多的检测，这推动了每个患者收集的数据量增加，这些数据可以整合到CPath工作流程中。例如，诊断不再仅仅基于组织学分析，还通过分子和免疫组织化学检测进行补充。多模式成像、空间分辨基因组学检测和3D病理学等新技术的出现将进一步加速这一趋势，为多模态集成提供新的机会**。
二、深度学习在 CPath 中的应用
深度学习在 CPath 中的方法论贡献可分为用于**预测临床终点的方法（如癌症亚型、患者存活率或来自 WSI 的基因突变），以及用于指导病理学家和研究人员并为其提供支持的基于人工智能的辅助工具（如分割图像或虚拟染色的方法）（详见文章底部附录1**）。
2-1：组织预处理
组织切片数字化包括**构建组织的金字塔结构，通过表示为多个放大倍数（或分辨率）的图像来实现**，通常从×40（约0.25微米/像素）到×5放大倍数（约2微米/像素）（图2a）。
（图2a）
在应用任何AI算法之前，数字化WSIs需要进行组织分割，以去除背景区域，这可以通过经典图像处理（例如图像阈值化【24】）或基于深度学习的方法（例如分割网络【25】）来实现。
由于WSIs的巨大尺寸（一个WSIs可以比ImageNet【26】样本大100,000倍，后者大小为256×256像素），直接处理在计算上要求很高。因此，常见的做法是**将WSIs分割成小片。通过分片，CPath框架可以采用分治策略，其中每个片都使用神经网络单独处理，然后将结果进一步汇总以得到切片级别和/或患者级别的结果**。
在高倍镜下（例如×40或×20），每个图像片都揭示了颗粒信息，如核形态。然而，只显示了小部分上下文，这可能会限制模型捕捉大范围上下文模式的能力。相反，在较低的放大倍数下（例如×10或×5）处理提供了每个片更多的上下文信息，如组织结构，尽管代价是分辨率降低。
因此，需要根据特定应用平衡上下文和分辨率；例如，某些癌症亚型任务，如肺腺癌亚型，可以在×5放大倍数下以临床级别的精度执行，而WSIs上的**遗传突变预测**通常需要×20或更高的放大倍数【27】。
2-2：多实例学习在WSI中的应用
CPath的一个目标是**根据WSIs预测与疾病相关的临床终点，这一任务被称为WSI分类。解决与WSIs巨大尺寸相关的计算瓶颈的一种方法是将切片分类重新表述为基于图像块的监督学习分类任务。这种方法涉及使用特征提取器（如卷积神经网络（CNN））处理每个图像块，以获得图像块嵌入**。然后将嵌入传递给预测器，以预测相应的图像块标签。
标签可以由病理学家通过手动注释感兴趣区域或为切片中的所有图像块分配相同标签来提供。在图像块分类后，使用聚合器将图像块级分数组合以做出WSI级预测（图2b）。聚合器可以是非参数化的，如取平均值、最大值或多数投票，或参数化的，带有额外的神经网络。
然而，图像块级监督方法有几个限制。首先，获取手动注释是耗时的，并且不能轻松扩展到成千上万的WSIs。此外，对于预后或治疗反应预测等应用，图像块标签的含义变得模糊，因为病理学家对这些区域几乎没有先验知识。肿瘤内异质性【16,28】进一步复杂化了即使在同一肿瘤区域内分配注释的任务。
此外，如果感兴趣的区域占据了WSIs的大部分，为WSIs中的所有图像块分配相同标签是可行的【27,29】。然而，当只有WSIs的一小部分是有区别的（例如淋巴结转移），图像块级标签变得非常嘈杂【30】。
另一种方法是**将WSI分类定义为多实例学习（MIL）【31,32】，其中为构成WSI的图像块集提供一个单一的监督标签，并假设只有该标签对应的一组图像块。这种设置也被称为弱监督学习**，因为图像块的数量远远大于监督标签的数量。
MIL通过三个步骤将图像块集映射到标签
- 首先，特征提取器为每个图像块提取**低维嵌入**（例如，1024维的嵌入）；
- 其次，**聚合器将图像块嵌入池化**为WSI表示；
- 最后，使用**预测器将该表示映射**到WSI标签。
与图像块级学习不同，WSI级标签不再分配给图像块，而是分配给构成WSI的图像块集。聚合器可以是非参数化函数，如图像块嵌入的平均值或最大值，或参数化函数，最流行的是注意力机制【33】。在基于注意力的MIL【2,30,34】中，每个图像块根据其嵌入对预测的重要性被赋予一个注意力分数，这进一步用于推导注意力加权和的图像块嵌入。基于注意力的MIL的一个优点是，这些注意力分数可以直接为定性形态分析**提供可解释的热图**。
然而，由于每个WSI中有大量的图像块，整个WSI图像块集和整个网络不能同时存储在GPU内存中。因此，MIL无法直接学习特征提取器和预测器的联合方法。解决这个问题的一个方法是**在辅助任务上预训练特征提取器以预提取图像块嵌入。通过这种方法，聚合器和预测器在已经压缩的图像块嵌入上操作**（例如，1024维的嵌入压缩了256×256的图像块，压缩因子约为200）。
在实践中，特征提取器可以在自然图像数据集上预训练，如ImageNet【26】（例如使用ResNet35），或带有辅助任务的病理学图像，或自监督学习【39–41】。不同的工程步骤可以通过访问主机内存或使用梯度检查点【43,44】来优化可用内存，以便进行特征提取器和预测器的联合训练。
尽管如此，这些策略复杂且计算负担重，因此到目前为止尚未广泛采用。另一种方法是**在训练期间随机采样WSI图像块的一部分**【45,46】，假设每次都会采样到相关信息。
尽管最近的基准测试显示，对于一系列任务（如肿瘤亚型），图像块级训练和MIL可以表现相似【47】，但我们认为**MIL方法将越来越受欢迎。首先，该领域正在向具有弱训练信号的更复杂任务发展（如生存预测），对于这些任务，图像块级监督并不适合。其次，新的硬件进步最终将允许以简单的现成方式联合训练特征提取器、聚合器和预测器以及整个WSI图像块集，这将使MIL能够结合更多的上下文信息**。
2-3：上下文感知方法
迄今为止讨论的方法**假设WSI图像块彼此独立，除了图像块中的上下文信息外，没有访问其他上下文信息。然而，这种观点限制了纳入所需建模组织结构的长期上下文的能力，特别是在仅局部细胞形态本身无法预测目标**（例如，用于治疗反应预测）的情况下【48】。
虽然**使用较低的放大倍数是一个简单的权宜之计，但这种策略可能会使用户错过细粒度的细胞细节。为了解决这个限制，MIL方法可以通过一个专门的神经网络明确地模拟图像块嵌入之间的相互作用。这种方法需要构建嵌入的关系结构——无论是作为图还是序列——并应用一个网络——无论是图神经网络（GNN）还是转换器——基于指定的结构整合和建模嵌入之间的相互作用。另一种方法是，MIL方法可以通过聚合来自多个放大倍数的图像块嵌入来隐式地结合上下文**。
上下文感知方法的优势在于，它们能够利用WSI中的更广泛的上下文信息，从而提高模型对组织结构和细胞间关系的理解。这有助于模型在处理复杂任务时，如治疗反应预测，能够更准确地捕捉和利用重要的组织级信息。此外，通过在多个放大倍数下聚合图像块嵌入，模型可以结合细粒度的细胞细节和更广泛的组织上下文，从而提高其预测的准确性和可靠性。
总之，上下文感知方法在CPath中的应用为解决WSI处理中的挑战提供了新的视角和工具。通过利用更丰富的上下文信息，这些方法有望进一步提高病理图像分析的准确性和临床应用的价值。
2-4：图表示和图神经网络
表示不同图像块之间交互的一种方法是使用图【50–52】，其中**图像块嵌入表示节点**，通过边（edge）连接（图2d）。
连接（或边）通常基于局部性原则定义，即**物理上彼此接近的区域更有可能相互作用，因此应该连接【50,51】。例如，一个图像块可以与其五个最近的邻居连接或与其所有相邻的图像块连接**。然后训练一个图神经网络（GNN）【53】（一种专门设计用于在图结构数据上学习的神经网络类别）来从图中预测感兴趣的目标。
在GNN中，图像块表示通过神经消息沿边传递，以捕获上下文（即，节点通过与邻居传递信息迭代更新其表示）。然后聚合上下文化的节点嵌入形成一个WSI嵌入。GNN可以训练在一个具有任意数量节点和边的图中，可以应用于任何WSI数据集，而不受组织的大小和形状的限制。
基于图的MIL方法**不仅限于在图像块级别工作，还可以用于模型核（节点）和核之间的交互（边），这种表示称为细胞图【50,54–56】。通常在核周围提取细胞嵌入来表征其外观**。这种公式类似于生物系统如何交互，因为核形态和细胞交互被明确编码。GNN通常训练将细胞图映射到临床终点，类似于块图方法。然而，由于WSI中的核数量可能非常高（高达数百万），扩展到大的组织区域仍然具有挑战性【57】。
图表示和图神经网络为病理图像分析提供了一种强大的方法，能够捕捉和利用图像块之间的空间关系和依赖性。通过将图像块视为图中的节点，并将它们之间的空间关系视为边，这些方法可以显式地建模和利用组织结构中的上下文信息。GNN通过迭代地更新节点表示来捕获上下文，这种能力对于理解病理图像中的复杂模式至关重要。
尽管处理大规模组织区域时存在挑战，但图表示和图神经网络在病理学中的应用前景广阔。这些方法有望提高病理诊断的准确性，尤其是在处理异质性和组织结构复杂性方面。随着技术的进步和计算能力的提高，预计这些方法将在病理图像分析中发挥越来越重要的作用。
2-5：序列表示和转换器
与GNNs不同，转换器假设所有图像块之间的交互，而不仅仅是基于位置的局部交互，这是转换器的核心思想（图2e）。
直观地说，对于每个图像块嵌入，转换器评估所有其他图像块嵌入对于上下文化其自身表示的重要性，这一概念称为**自注意力**。在一系列自注意力层之后，一组图像块嵌入被汇总为最终的具有全局上下文意识的WSI嵌入。遵循转换器的术语，所有图像块嵌入都被表示为一个序列，序列中的位置指示了图像块在WSI中的空间位置。
从概念上讲，这种策略可以被视为GNN的一种推广，其中所有图像块都连接到彼此（包括全局上下文）而不是仅限于局部连接。然而，由于**交互的数量与图像块数量呈二次关系，这种方法在训练时间和GPU内存方面在计算上非常昂贵。这种限制使得在当前硬件上进行端到端训练更加复杂。为了降低计算负担，已经提出了计算复杂性较低的转换器，通过重新表述或近似图像块之间的交互【59,60】。广泛地说，图像块之间的交互也使用循环神经网络【36,61】或转换器的变体【**62】来实现。
目前尚不清楚基于转换器的方法在预测性能、对领域变化的鲁棒性和泛化能力方面是否优于基于图的方法。一方面，对于已知先验上下文类型的应用（例如，根据某些局部性原则），图表示更接近于模拟生物系统之间的交互，并为图像块之间的交互提供了更多的控制。另一方面，转换器具有较低的归纳偏差，因此它们对网络施加了较少的约束。因此，通过学习图连接性注意力权重，转换器更有可能发现新的长程上下文生物标志物。
序列表示和转换器为病理图像分析提供了一种新颖的方法，它**不受位置限制，能够考虑所有图像块之间的交互。这种全局视野对于捕捉病理图像中的复杂模式和关系至关重要。尽管计算复杂性较高，但转换器提供了一种强大的工具，可以探索WSI中未知的、可能与临床结果相关的长程依赖关系。随着技术的发展和计算能力的提升，预计转换器将在病理图像分析中发挥越来越重要的作用**。
2-6：多尺度表示
除了在单一放大倍数上包含上下文外，还可以通过**使用WSIs的多尺度表示来实现上下文，例如使用×5、×10和×20的晚期融合方法【4,63,64】。这种方法聚合（例如，通过串联或求和）不同放大倍数的WSI表示或提取多个放大倍数的同心图像块【64】。必须强调的是，这些策略与所使用的底层MIL框架无关。另一种方法是实现一个专门的机制，学习如何放大到与诊断相关的区域【65–67】，类似于病理学家检查诊断WSI的方式，从而减少计算，因为不需要在不同的放大倍数级别处理所有WSI图像块**。
多尺度表示为病理图像分析提供了一种灵活的方法，它结合了不同放大倍数下的信息，以获得更全面的组织结构和细胞关系视角。这种方法允许模型在不同的分辨率级别上捕捉和组织中的细节，从而提高其对病理变化的检测和解释能力。
晚期融合方法是一种简单有效的方法，它通过**结合不同放大倍数的WSI表示来提供上下文。这种方法不需要对所有图像块在不同的放大倍数下进行处理，从而降低了计算成本。此外，通过专门的学习机制，模型可以识别并放大到与诊断相关的关键区域**，这有助于模型集中精力在最重要的部分上，进一步提高其诊断的准确性和效率。
总之，多尺度表示为病理图像分析提供了一种强大的工具，它能够结合不同放大倍数下的信息，以获得更全面的组织结构和细胞关系视角。这种方法有望提高病理诊断的准确性，尤其是在处理异质性和组织结构复杂性方面。随着技术的进步和计算能力的提高，预计多尺度表示在病理图像分析中的应用将越来越广泛。
三、基于人工智能的辅助工具
病理学领域的深度学习还被用于开发基于人工智能的辅助工具，这些工具可以从 WSI 中提取可操作的对象和表征，供后续临床或研究使用。这些工具**主要用于组织和细胞核分割以及虚拟染色**。
3-1：分割工具
分割是计算病理学（CPath）的一个重要工具，用于**将WSIs分割成不同的组成部分，例如核、腺体或组织区域。分割对于通过客观和定量地关联形态特征与临床结果**来辅助临床诊断至关重要。
分割可以是语义性的，其中目标是将形态类别标签分配给每个像素，也可以是**实例分割**，它除了为每个对象实例分配一个实例标识符外，还分配一个实例标识符。
语义分割
主要用于上皮与间质的分割【68,69】、Gleason模式的检测【70】或组织分割【71】。
**语义分割网络**通常使用全卷积网络（FCN）和U-Net架构。具体来说，一个CNN编码器将输入（通常是组织图像的一个片段）压缩成一个空间感知的嵌入，其中每个元素对应于原始输入中的一个特定位置，并且一个对称的CNN解码器扩展并转换嵌入为一个带有每个像素分配标签的分割掩码。这些网络可以修改为将语义分割输出转换为实例分割，无论是通过一个专门的附加分支【72】，还是通过实施后处理步骤。
实例分割
则用于分割核【72】、腺体【73】和有丝分裂细胞【74,75】，其中每个实体的描绘都很重要，例如，用于测量每个细胞和腺体的HIFs。
Mask-regional CNN也可以用于**实例分割**，其中一个对象检测器首先应用于图像，使用一个专门的检测分支基于潜在嵌入来识别图像中的对象。每个检测到的对象然后通过直接为每个像素分配一个标签和一个实例标识符来进行分割。
大多数基于深度学习的分割方法在完全监督的环境下运行，因此需要细粒度的像素级标签，这些标签详细描述了图像中的每个实体或组织。
尽管深度学习框架已经在分割任务中取得了令人印象深刻的性能，但注释过程仍然需要大量的资源和病理学家的支持。为了解决这个限制，已经引入了**专门的注释工具【79,80】或人机交互方法**，以交互式地校正模型的预测【81】。
此外，弱监督语义分割流水线可以**使用粗略标签从大块或甚至WSIs分割图像【70,71】。然而，它们的性能仍然不如完全监督的对应物。与此同时，与H&E染色类似，分割方法正在应用于免疫组化（IHC）和多模式图像**，例如，用于核和膜的分割【21,81–83】。
3-2：虚拟染色
虚拟染色包括**使用算法改变图像的外观。在CPath中有两个应用：染色增强用于校正、标准化和增强染色，以及染色转换，用于将图像从一个染色/图像模态转换为另一个**。
由于不同机构之间在组织处理和数字化协议上的差异，WSIs通常具有不同的外观，这可能会负面影响深度学习系统的性能。染色标准化可以用来减轻这些偏差，提高模型性能和对领域变化的鲁棒性【84,85】。尽管染色标准化传统上涉及染色向量的估计【86,87】，但**通过数学建模像素间的颜色映射，深度生成模型也可以用来训练一个模型，以生成具有参考数据集染色强度的输入图像【**88–90】。
深度生成模型还可以将H&E冷冻切片（通过快速过程生成，可能产生人为误差）转换为H&E石蜡包埋切片（一个较慢的过程，受噪声影响较小）【91】——这种应用可以**在更短的时间内提供高质量的切片**，例如在手术操作中。因此，染色增强应用可以增强深度学习模型的可靠性，并帮助病理学家减少样本之间的视觉变化。
使用深度生成模型进行染色转换也是一个有前景的方向，可以**转换图像从一个染色或图像模态到另一个**，这是一个尤其困难的任务，因为两种模态之间固有的不同的成像协议。例如，图像可以从H&E染色转换到IHC和多模式图像【92,93】，以及从紫外显微镜转换到H&E【94】。
尽管这些方法**最好在两个域的配对图像上进行训练，但最近开发的算法使得可以使用未配对数据【95,96】，从而大大简化了数据收集。尽管关于虚拟染色图像在临床上是否可应用尚无共识**【97】，我们认为，随着深度生成模型的快速发展，这些图像在CPath中将扮演越来越重要的角色。
3-3：可解释的CPath
深度学习方法做出决策的能力，以及解释、证明和理解这些决策的重要性，对于建立AI系统与病理学家之间的信任关系至关重要。特别是在临床环境中，这些区域可以用于确保方法的可靠性，通过与专家知识进行比较，并作为自动选择感兴趣区域的指标。在研究环境中，确定描述显著区域的形态特征有助于生物标志物的发现。然而，由于模型的固有复杂性，确定这些区域并理解深度学习方法做出决策的机制并不总是直截了当的。
为了克服这个限制，已经提出了**基于梯度重要性的特征归因方法**【99–101】（图3）。
中心思想是迭代恢复由神经网络激活最多的深层特征回到输入（例如，回到图像块嵌入），从而导致生成一个显著性图，其中**输入的每个元素都被分配一个分数，表示该元素对预测的重要性。另一种基于注意力的方法允许直接解释学习到的注意力权重作为重要性分数来解释预测**【2,14,30,34,102】。尽管这两种方法主要应用于产生图像块级重要性评分的WSI分类系统，但它们也可以与图像块分类（产生像素级评分）或细胞图分类（产生核级评分）一起工作。
尽管这些分析提供了宝贵的洞察力，但高重要性分数并不一定证明存在某种类别的特征，研究人员必须定性确定每个区域选择的原因。作为一种潜在的解决方案，提出了将MIL重新表述为从WSI级标签训练导出图像块级预测的方法【103】。另一个限制是，这些方法受定性考虑的限制；因此，具有图像块分辨率的显著性图无法直接描绘出负责预测的形态特征和核。因此，**需要基于分割框架和从分割实体衍生出的HIFs的定量形态表征来补充可解释性分析，以确定发现结果【**11】。这些表征可以通过研究基于形状、大小或色度的大腺体或核形态描述符，以及基于密度、分散或组织结构的基于图的拓扑描述符来实现。
最终，临床预测的解释可以包括深度学习预测方法产生的显著性图和HIFs的定性考虑和定量表征的组合。一个典型的流水线首先会训练一个基于深度学习的预测模型，用于某种预测任务，例如癌症分级。接下来，使用可解释性工具（如基于注意力的显著性图）从预测中产生测试组织图像的显著性图，为定性分析提供依据。最后，计算并汇总显著性图中重要区域的HIFs，进行定量形态分析。
这种工作流程的示例包括研究重要图像块中核的属性和交互【2,102】（图3a,e），
或重要细胞图表示中的核【105】（图3b,e）
这种通用工作流程在很大程度上与染色协议（图3c,e）或特征归因方法（图3d,e）无关。
四、CPath 的临床影响
自推出以来，CPath 一直在追求两个互不排斥的主要目标：实现常规临床工作流程的部分自动化
以及**利用同一工作流程中的数据**（有时还辅以其他数据源）获得新的见解（图 4）。
4-1：Cpath自动化
在细胞和组织层面
人工智能在计算病理学（CPath）的应用主要**针对那些既繁琐又容易受到观察者间变异影响的工作。例如，有丝分裂的检测和计数【69,75,106】，以及免疫组化（IHC）的量化【93,107-109】，这些任务特别适合自动化处理。在这些工作中，实例分割是一种常见策略，尤其是对于细胞核的分割【72,110】。通过这种分割，可以进行各种下游分析，如细胞图模型用于组织分级和亚型分类【**50,54,55,105】，自动量化PDL1阳性肿瘤细胞的百分比【111】，或检测恶性的白细胞【112】。
在计算病理学中，组织结构的语义分割是另一种流行的应用，包括上皮和腺体的分割【69,80,113】，血管和神经的分割【114】，以及前列腺腺癌腺体的分割【115】。与细胞分割类似，分割出的组织可以组合形成肿瘤微环境级别的特征【104】和预后生物标志物，如肿瘤与间质面积比【116】和肿瘤浸润淋巴细胞的评估【117】。细胞和组织的分割也可以同时进行；例如，非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪肝炎的组织学分级系统整合了来自细胞（如肝细胞损伤和小叶炎症）和组织（如纤维化）的信息，这些信息可以由分割网络得出【118,119】。
在全切片水平
基于人工智能的全切片图像（WSI）分类是一个非常活跃的研究领域，为提高诊断的准确性和可重复性提供了巨大的前景。这些算法整合了整张切片的信息，而不仅仅是单个细胞或感兴趣区域的信息，类似于**病理学家为了得出最终诊断必须检查整张切片**的方式。这些方法可以减少某些任务中的观察者间变异性，例如，在乳腺癌中，对非典型增生的检测几乎有50%的观察者间变异性【120】，这种变异性即使在多年的专业训练后也是不可避免的。
分级，即根据异常细胞和组织相对于健康组织的表现进行量化，是许多疾病，包括癌症诊断的一个重要方面。特别是，由于前列腺癌活检在许多临床实践中数量庞大，且任务的高观察者间变异性，前列腺癌的Gleason分级成为了计算病理学领域的一个重点研究内容。多机构研究分析数千个样本现在可以达到与病理学家相媲美或超越的Gleason分级性能【3,121,122】。人工智能辅助分级也已经应用于其他类型的癌症，包括胶质瘤【123】，结直肠癌【55】和乳腺癌【124】，以及心脏【63】和肾脏【125】移植排斥。
在计算病理学中，诊断也常常被构建为一个亚型问题，即**算法旨在将病例分类到一组诊断中**；例如，根据淋巴结中转移灶的二进制存在与否进行分类，或将非小细胞肺癌病例分类为腺癌或鳞状细胞癌。这些任务通常被呈现为多类分类问题，其中既可以应用补丁级监督，也可以应用多示例学习（MIL）。亚型已经在多种疾病中得到应用，包括结直肠癌【126】，皮肤癌【127】，胃癌和结肠癌【61】，肝癌【128】，乳腺癌【50】和肺癌【34,59】，以及在检测淋巴结转移灶【5,51】等方面，甚至可以预测肿瘤是原发还是转移性，并确定其原发部位，如果为转移性【2】。
如果将这些方法与能够将组织外观转换为临床医生熟悉的领域的人工智能模型相结合【91,94】，或使用替代成像技术【130】，如人工智能辅助增强现实显微镜【131】或基于人工智能的病理学家工作负担缓解工具【132】，这些方法才能真正改善临床实践。最后，计算病理学系统可以作为预筛查工具，减少后续测试的数量，从而缩短达到最终诊断的时间。例如，预测转移性癌症的顶级原发候选部位可以减少所需的免疫组化（IHC）测试数量【2】。不同地，微卫星不稳定性——在15%的结直肠癌中检测到的基因组生物标志物，免疫治疗对该疾病有效——可以从全切片图像中高灵敏度地检测出来，从而识别不需要进一步测试的患者【133】。
4-2：Cpath用于发现
诊断、分子标记预测和生物标记发现利用组织学、基因组学和其他数据模式来完成病理学家和临床治疗医生无法完成的任务，这可能是因为他们从未接受过这方面的培训，也可能是因为这些任务主要依赖于深度学习在高维数据中识别连接的能力，而这种能力是人类所不具备的。
预后
预后模型旨在预测疾病进展的风险，例如，通过评估癌症复发和转移的风险，最终预测患者的生存概率。预后预测尤其困难，因为**预后的形态学相关性通常不被很好地理解。这可以归因于患者间的异质性，这种异质性导致了模糊性，阻碍了建立适用于所有患者的标准；此外，预后是多种因素的综合**，如遗传标记、临床特征（如年龄或并发症）和治疗反应，其中只有部分可能在组织中反映出来。此外，对预后形态学相关性的有限理解使得组织的手动注释具有挑战性，使得不依赖手动像素注释的方法，如多示例学习（MIL）框架，变得吸引人。
由于预后的复杂性，患者通常被分入具有显著不同结果的 risk groups，而不是被赋予一个精确预测的生存期。几个泛癌症和特定癌症的研究表明，组织学数据可以**预测患者的生存【4,100,134,135】，复发风险【136-139】和转移风险**【140,141】。特别是，一些生存分析显示，基于深度学习的患者分层可以比现有的预后生物标志物【4,14】（如临床分级和分期）更好地区分风险组。这些进步可能改善患者的治疗，并有助于为不同风险组提供量身定制的疗法【142】。
此外，**比较不同风险组之间显著区域的组织学特征和组织成分可以揭示病理学家未知的预后生物标志物【**143,144】，这可以指导治疗发展的目标识别。
鉴于疾病进展和治疗效果主要受涉及不同遗传和表型因素的复杂过程控制，预后研究越来越多地包括全切片图像（WSIs）中的上下文【14,48,51,59】（例如，通过依赖图形表示）或使用其他模式【145,146】。具体来说，多模式整合涉及组织学（例如，补丁嵌入和细胞特征）和**放射学（如放射组学特征）数据，以及分子分析（如拷贝数变异、突变状态和批量RNA测序）的结果和临床变量（如年龄和性别）的评价【55,102,147-150】。例如，在一项泛癌症研究中【102】，将组织病理学数据与分子分析结果相结合，与单独使用任何一种方式相比，在大多数研究的癌症类型中提高了生存预测的可靠性。类似地，结合不同免疫细胞的IHC染色改善了预测结直肠癌复发风险的能力**【151】。
分子特征预测
组织学数据与分子分析数据之间的联系，如免疫组化（IHC）和批量DNA测序数据，也在积极研究中。
尽管这些分析的成本和复杂性持续降低，但它们仍然昂贵、耗时，并且不常规进行。因此，能够从相对便宜且广泛可用的苏木精-伊红（H&E）图像准确预测这些结果的模型非常吸引人。这类模型还有助于发现与分子改变相关的新形态学生物标志物。确定这些形态学特征对于开发新药物和疗法至关重要，因为它们揭示了靶向治疗如何影响组织形态【17】。
**这些发展都是基于分子改变可以以不同方式影响细胞形态和周围肿瘤微环境的发现【**152】；例如，组织切片可用于预测某些突变，如泛癌症【29】、特定疾病研究【154、155】以及基因表达【156】、微卫星不稳定性【133】、分子亚型【157、158】、PDL1状态【159】和蛋白表达【160】所展示的。
通过研究负责预测的区域形态学，可以提取新的生物标志物，进一步阐明表型与基因型之间的相互作用。这些研究大多使用了切片级别的标签，这是常见的批量测序分析的一个局限性，因为它们只能提供全切片图像（WSI）级别的描述。在这种情况下，既使用了补丁级监督（所有补丁分配相同的幻灯片级别标签），也使用了**多示例学习（MIL）。空间分辨测序技术，如空间转录组学的日益可用性，激发了人们了解特定形态学与单细胞分子特征之间联系的兴趣。从H&E图像预测空间转录组数据【161】和空间分辨蛋白表达**【162、163】为以前超出批量测序分析范围的研究开辟了新途径。
治疗反应预测
计算病理学（CPath）还可以帮助预测患者对治疗的反应。例如，已经**开发了人工智能系统来预测对免疫治疗【164-167】、靶向治疗【168、169】和化疗【170】的反应**。由于治疗反应的评估依赖于不同的患者特征，因此这些研究的多模态性质并不意外【151,171,172】。
然而，收集大型数据集的困难仍然是主要挑战，通常需要回顾性分析临床试验数据。相反，可以从组织学中预测突变的模型作为替代，因为**高肿瘤突变负担和微卫星不稳定性本身可能预示对治疗的反应【**173】。
五、展望
尽管 CPath 取得了长足进步，但挑战和机遇依然存在，这些挑战和机遇可分为与数据采集和处理相关的进展、与构建新人工智能方法相关的进展【174-178】（图 5）以及临床应用的转化考虑因素（Box 3）。
5-1：数据
要实现精准医疗的目标，就必**须开展越来越多不同的检测，每种检测的空间和时间分辨率都要更精细**，从而大幅增加每位患者的可用数据量。这一趋势不仅使数据收集工作变得更加复杂，也给方法学带来了新的挑战。
病例检索
大多数医疗机构都有一个可搜索的病理报告数据库，这对于许多任务都非常有帮助，比如查找患者的先前病理结果是如何签发的，识别罕见疾病的病例，以及后来检查它们的形态学。
这些文本数据库只包含了导致那些病理报告产生的切片上的极小部分信息，尤其是在那些不包括显微描述的实践中。允许病理学家搜索图像本身的工具开启了许多其他可能性【179–181】，例如简化查找具有某种形态学的病例以帮助做出诊断，检测误诊的病例，以及比较患者原发肿瘤的形态学以评估潜在的转移风险。
多模态整合
尽管已经证明了在结合多个模态的数据时可以提高预后性能，但要实现其全部潜力，仍然存在挑战。
首先，现有的多模态数据集通常只有几百个样本（如omics和组织的TCGA队列），这比拥有成千上万WSIs的CPath研究小得多【2,36】。然而，向更大规模的数据集的过渡构成了一个主要的后勤挑战；
在回顾性研究中，多模态数据可能分散在多个机构，使数据收集复杂化，并增加了许多患者缺失模态的风险。
在前瞻性研究中，随着模态数量的增加，整体成本可能会显著增加；例如，全基因组测序，如TCGA所示，对于大多数机构来说仍然是不切实际的。即使有足够的财务资源，积累这些数据也需要多年的时间。
尽管如此，考虑到对多模态研究的热情，我们预计将会有更多的工作致力于结合组织学、放射学、电子病历记录和下一代成像技术，例如空间分辨转录组学。更大规模的数据集和更多模态的前景已经导致了新的方法学进步；例如，现在正在**探索早期融合方法，以直接在编码管道中考虑局部跨模态相互作用【**150】。
此外，处理缺失模态的方法（而不是简单地移除缺失模态的病例）也正在受到关注，例如，使用多模态dropout【148,182】。
编码时间性
纵向（或时间性）的疾病进展研究对于持续监测患者健康状况至关重要，例如，以理解心脏和肾脏移植排斥的动力学，或者帮助确定新癌症治疗在临床试验中的有效性。然而，纵向数据收集在后勤上非常复杂，因为检测不总是由同一机构进行的，而且在患者之间和患者内部获取数据的时间间隔不一致。
下一个数据倡议的迭代，例如**癌症登月计划**【183】，可以通过大规模收集纵向跟踪的癌症数据来改变这一局面。由于纵向组织活检不能在完全相同的解剖位置提取，建模和整合器官内的异质性将特别具有挑战性，并需要新的方法学贡献。
三维病理学
人类组织本质上是三维的，而计算病理学（CPath）分析主要基于二维切片，因此可能会忽略重要的形态学区域【23】。为了克服这一限制，一种方法是从连续切片的对齐苏木精-伊红（H&E）组织切片进行**三维重建，以在亚细胞分辨率下可视化整个组织，无需特殊样本制备协议或设备【**184】。
另一种选择是使用先进的成像技术，如开顶式光片显微镜【185】、紫外表面激发显微镜【186】和微计算机断层扫描【187】，来捕获高分辨率的保留组织的肿瘤三维表示。这种方法避免了为准备二维切片而进行的破坏性微切片过程，其实现可能会改变原始组织形态。
由于**三维形态在疾病表征和更准确的病人预后方面具有前景**【188】，我们预期三维CPath研究将取得进展，特别是随着可用于三维病理的三维建模计算机视觉方法变得更加可用。
然而，挑战依然存在，因为成像工具对临床部署仍然过于昂贵，且当前的病理学教育课程完全基于二维形态。至少在可预见的未来，这些技术很可能首先用于研究目的，然后才能整合到常规临床工作流程中。
下一代成像技术
新兴的多元成像技术，如免疫荧光和生色免疫组化，以及质谱或流式细胞术，允许在同一组织切片中同时评估多个生物标志物，达到单细胞分辨率。每种技术在标记数量、分辨率、最大图像大小、获取时间和成本方面都有其优势和局限性。
多元成像对于理解肿瘤微环境中的肿瘤异质性以及发现预测治疗反应的细胞和分子特征尤其有前景——这些任务不可能仅从H&E图像中完成【189】。在计算病理学（CPath）中，多元图像研究主要基于实例分割算法，这些算法能够**进行核级别分析**，使用的是手工特征【83】或基于细胞图的图神经网络（GNNs）【190,191】。
随着多元图像队列大小的增加，我们预计将适应多元图像的H&E图像分析成功的食谱，例如，使用多示例学习（MIL）【192】。
去中心化学习
尽管通过多机构合作收集大规模队列提供了更多样化数据的前景，但数据存储的成本、隐私问题和可能泄露竞争优势的风险通常意味着**数据不能存储在单一位置【**193,194】。
这一限制要求**开发新的去中心化训练策略——这对深度学习模型来说是一个公认的挑战。特别是，在多机构训练期间，异步填充更新模型参数到不同位置并不是一件简单的事情**。已经提出了不同的技术来减轻实现去中心化训练的困难，例如联合【195-198】、持续【199】和群体【200】学习；然而，尽管结果令人鼓舞，但这些技术仍然是概念验证，尚未被临床机构采用。
即使建立了多机构合作，确保和维护不同机构之间一致的软件堆栈也是一个重大挑战，这些机构的信息技术基础设施并不是为了训练大规模深度学习系统而设计的。尽管如此，我们预期去中心化学习将被转化为无法以其他方式进行的大规模研究，例如，为了建模每个机构只有少数患者收集样本的罕见疾病。
公平性和偏见
算法偏见，尤其是**由于数据集中的种族、民族、社会经济地位和性别差异所导致的不公平现象**，目前尚不完全理解。一些开创性的工作已经识别出了现有模型中的此类偏见，例如，在估计患者风险时【201,202】。
在计算病理学（CPath）中，大多数数据集倾向于欧洲血统的人（在TCGA中，82.0%的病例是白人，10.1%是黑人或非裔美国人，7.5%是亚洲人）；因此，理解这些偏见的影响并确保深度学习方法对不同群体同样有效是至关重要的【203,204】。
偏见可以通过收集更多样化的数据集来减轻，这些数据集更好地涵盖了表型多样性，并确保了来自代表性不足群体的个体的代表性。因此，构建这样的大型、无偏见的队列是CPath未来的一个关键步骤，这需要依赖多机构合作。
除了更好的数据收集之外，使用深度生成模型生成合成数据【195,205】也可以用来增加来自代表性不足群体的病例比例。此外，可以**开发新的训练方法来减轻偏见**，例如基于加权抽样的方法【206,207】。
5-2：学会更好地特征表达
开发用于学习更好的病理数据表示的工具也至关重要，特别是对于建立健全和可推广的 WSI 表示法。
特征提取器架构
用于提取补丁嵌入的神经网络在很大程度上遵循了计算机视觉领域的趋势。
从使用带有大卷积核的CNN（如AlexNet）开始，社区已经采用了更深层的CNN，其特点是**使用更小的核和残差连接**（如ResidualNet和EfficientNet），并且目前正在探索视觉变换器【18,40】或CNN与变换器混合架构【39】。我们预期CNN和视觉变换器的发展将继续被应用于CPath应用。
自监督学习在病理学数据中的应用
自监督学习（SSL）是一种有前途的表示学习训练范式，特别是用于构建补丁嵌入。与使用外部标签不同，SSL直接从训练数据中提取训练信号，利用其结构，因此得名自监督【19】。尽管从理论上讲，从头开始训练模型（从特征提取器到预测器）可以提供最佳的预测性能，但存在过拟合的风险，因此缺乏泛化能力。基于SSL预训练的特征提取器的迁移学习对于解决这一限制特别有前景，因为**SSL可以在不需要注释的情况下提取特定于领域的补丁嵌入**。
在CPath中已经提出了许多补丁级别的SSL训练策略【41,208-212】；例如，可以学习将补丁及其增强版本（通常是基于与病理学相关的转换，如随机旋转、裁剪和染色抖动）映射到相似的嵌入（图5b），学习全局和局部细节之间的对应关系【40】，或重建补丁中随机遮挡的区域【213】，所有这些方法都源自于用于自然图像的SSL技术。
此外，可以利用来自同一WSI的补丁或共享相同标签的补丁之间的相似性，例如，通过将语义上或空间上接近的补丁匹配到相似的嵌入【39,210】。SSL正在成为预训练特征提取器的标准，越来越多的研究表明，SSL策略可以提供比监督学习方法更解耦、更稳健和更具泛化能力的表示【39-41】。
此外，SSL正在被探索用于**学习WSI嵌入，例如，通过利用组织学切片层次结构的特点【40】。这种方法特别有前景，因为其实施将简化训练过程至最小的模型微调**【214】，特征提取器和补丁聚合器已经通过SSL进行了训练，这将使在WSI级别实现少样本学习成为可能。
鲁棒性和不确定性
构建能够在不同环境中稳健运行并具有泛化能力的模型对于临床部署至关重要，以确保在受控环境中针对精心策划的数据集训练的模型能够不受环境、机构特定因素的影响而保持相同的性能。
然而，域转移对AI系统来说很难建模和检测，这些系统通常会产生过于自信的预测，无法识别系统可能表现不佳的情况——这种现象被称为**模型误校准**。这些挑战在病理学数据中尤为常见（图5c）。
由于多种因素，如不同机构实施的染色协议差异、使用不同的扫描设备，每种设备都有特定的颜色响应，或者训练和测试数据中的不同子群体具有独特的表型特征，很容易引入偏见。
尽管通常会**使用染色标准化和增强方法【86,87,215】、或保留站点的分层【216】来减轻这些偏见，但AI系统的临床部署必须伴随着监控模型行为的保障措施。一个有前途的方向是为深度学习系统配备不确定性估计机制，例如基于模型集成【217、218】（使用不同权重初始化训练的多个模型进行推理）和测试时增强**（对测试数据进行各种数据增强以产生多个副本）。这些方法为每个WSI或患者提供了多个预测，可以聚合以获得更可靠的输出预测，并附有置信区间以表达不确定性【219】。这些方法还可以进一步用于检测输出高度不确定且不可信的异常样本【220-222】。
AI算法还必须对不平衡数据集具有鲁棒性，这在罕见病检测中经常遇到。如果没有专门机制，深度学习系统倾向于多数类，存在高估模型性能的风险，尤其是如果不对选择指标给予特殊考虑。此外，还应小心确保一个在预测临床结果，如基因突变或风险评分方面表现良好的系统，不会受到其他临床协变量，如位置、种族或性别的混淆【223】。
总体而言，确保AI解决方案的鲁棒性将需要重大的方法学进步，也许更重要的是，需要大规模的多机构合作来构建更好的数据集。
六、总结
计算病理学（CPath）领域的进展加速因素并未显示出减弱迹象，从数字化日常临床工作流程的进步到人工智能的进步都是如此。尽管自动化劳动密集型手工工作和减少病理学家之间诊断变异的承诺已经很有吸引力，但CPath同样有潜力通过实现反映分子改变、患者预后和治疗反应预测的形态学生物标志物的发现，成为病理学研究的一个重要组成部分。
为了CPath对临床实践和生物医学研究产生影响，它必须同时关注两个目标：构建大规模、多样化和多模态的队列，以及使用更好的深度学习框架推进组织表示学习。这些目标不太可能在单一组织内实现。只有通过多机构数据收集倡议、开源软件包和持续从计算机视觉和人工智能研究的进展中获得技术灵感，上述目标才能实现。
附录1：公共数据集和开源代码
以挑战赛或开放数据库的形式创建公共数据集的举措极大地促进了计算病理学（CPath）方法论的进步。
癌症有丝分裂检测（MICO、TUPAC 和 MIDOG）
文献编号：224-226
淋巴结乳腺癌转移检测（CAMELYON16 和 CAMELYON17）
文献编号：5,227
前列腺活检的格里森分级（PANDA）
文献编号：3
乳腺癌亚型分析（BACH）
文献编号：228
泛癌症细胞核分割与分类（MoNuSac）
文献编号：229
结肠图像中的腺体分割（GlaS）
文献编号：73
截至目前，主要的资源仍然是癌症基因组图谱（TCGA）计划，其中包括跨越 33 种癌症类型的 11,000 多个病例，以及成像、omics 数据和患者信息。TCGA 是确定 CPath 新问题声明的主要驱动力。其他计划包括临床肿瘤蛋白质组分析联盟（CPTAC）和国家肺部筛查试验（NLST）。
正在进行的旨在建立更大病理数据银行的努力包括 Big Picture【230】、PathLake、英国基因组学病理成像收集【231】 和英国生物银行。为提高 CPath 的可重复性并减少模板代码，已开发出多个开源库和软件程序，以促进对新出版物的理解并加快新方法的开发【232】。
如今，这些库和软件包可用于
高效的 WSI 阅读
文献编号：【233】
数据可视化和注释
文献编号：【234】
WSI 修补和深度特征提取
文献编号：【34,235】
组织检测与背景对比
文献编号：【34,236】
染色规范化
文献编号：【236】
图形建模
文献编号：【120】
多模态数据输入
文献编号：【235】
语义和实例分割网络
文献编号：【237】
注意力网络
文献编号：【34】
组织学图像上的预训练图像编码器
文献编号：【39-41】
由于开源库本身存在开发者不对其进行定期维护的风险，因此未来仍有必要在社区层面为其提供一致的支持。
附录2：转化方面的考虑
截至目前，计算病理学（CPath）领域中很少有工作对临床产生了影响，只有一个CPath系统获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，在欧洲联盟只有少数几个系统获得了CE标志。AI系统创作者要获得监管批准必须克服的障碍是多样的，包括全切片扫描仪不是无处不在，使得数据获取变得复杂。这一限制意味着**几乎所有发表的CPath研究都是回顾性的；此外，与任何给定数据类型的多样性相比，数据集的大小相对较小，外部验证队列并不普遍**。因此，尽管在许多人工智能（AI）子领域中都存在一般化差距，但在CPath中尤其严重。
尽管监管机构在AI软件方面没有丰富的经验，但他们最近开始采用指南并与AI专家协商，这在一定程度上是由放射学领域监管申请的大量增加所推动的。例如，FDA最近发布了一份“作为医疗设备的人工智能和机器学习软件行动计划”，概述了该机构打算采取的监管此类软件包的步骤。此外，FDA的科学工程实验室运行不同的研究项目，包括FDA设备与放射健康中心的人工智能/机器学习项目。最后，FDA还参与了一些涉及行业和学术界AI专家的合作社区，如病理学创新合作社区。
尽管数量不多，但**获得监管批准的系统涵盖了CPath应用的范围**，从用于检测可疑前列腺癌焦点的Paige Prostate，到用于自动识别和分析乳腺癌中Ki-67免疫组化的人工智能系统Mindpeak Breast Ki-67 HS，再到根据结直肠癌全切片图像预后判断的DoMore Diagnostics Histotype Px Colorectal。
其他几家公司正在积极开发用于临床的CPath工具，例如Owkin、DeePathology、Tempus、Stratipath、Visiopharm、PathAI、Ibex和Indica Labs；然而，CPath算法的实际临床采用和监管批准仍然是罕见的。
临床使用此类系统需要全切片扫描仪和相关信息学基础设施来存储切片；它还需要**将切片送达算法并将结果送达病理学家**，这可能非常昂贵。其他信息学障碍包括与病理学实践的实验室信息系统及电子病历的互操作性；实际上，尽管这些通信在理论上听起来很简单，但在实践中需要大量的资源，尤其是如果需要将图像和算法结果集成到医院系统的放射学基础设施中。
即使克服了所有监管和基础设施障碍，使用CPath软件解决方案也不是保证的，并且取决于临床医生的接受程度和成本效益。因为**AI系统对医学来说是新的，临床医生通常对它们的工作原理和最佳使用方式知之甚少。这个问题可能会导致一定程度的信任缺失，尤其是考虑到AI应用程序往往被视为无法解释的黑箱。即使建立了信任，医疗保健系统和个别临床医生也只有在能够支付这些工具的情况下才会使用CPath工具**。为此，需要证明工具采用后成本降低和结果改善，或者在某些医疗保健系统（如美国）的情况下，发布特定的计费代码，允许临床医生因使用该工具而获得报销。
临床益处的有力证明只是临床采用漫长道路上的第一步，但围绕CPath生态系统的学术兴趣和投资者强大的财务激励看起来很有希望。此外，几家制药公司正在建立实验室，研究CPath如何改善药物发现工作流程，包括开发将在临床上采用的计算生物标志物，以预测对治疗的反应（或不反应）。所有利益相关者的日益参与表明，获得监管批准并最终被临床采用的CPath系统数量可能会增加。
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