《H&E 图像上的三级淋巴结密度是可切除肺腺癌的预后生物标志物》·文献精读

最新推荐文章于 2024-05-22 10:47:03 发布

罗小罗同学

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分类专栏： AI&临床文献阅读文章标签：病理切片三级淋巴结肺腺癌人工智能病理

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一、摘要

本研究内容概述了一项**多中心研究，该研究旨在开发一种自动计算工作流程，用于量化肺腺癌（LUAD）患者常规苏木精和伊红（H&E）染色全切片图像（WSI）中肿瘤区域三级淋巴结构（TLS）的密度。研究进一步探讨了来自三个队列的802名患者的TLS密度与无病生存期（DFS）之间的关系。此外，研究还建立了一个考克斯比例风险回归模型，以评估结合临床病理变量和TLS密度的预后能力**。

研究结果显示，LUAD患者中TLS的增加与良好的预后有关。由于手动评估TLS是一个依赖经验且耗时的过程，限制了其临床应用，我们开发了一种自动计算工作流程，用于量化LUAD患者H&E染色WSI中的TLS密度。研究发现，TLS密度是可切除LUAD患者的独立预后生物标志物。将TLS密度与临床病理变量相结合可改善预后分层，并支持个体化临床决策。

二、引言

本研究内容旨在介绍肺腺癌（LUAD）的背景信息，包括其高发病率和高死亡率，以及**准确分层以帮助做出个性化临床决策的必要性。此外，本研究还讨论了目前量化三级淋巴结构（TLS）方法的局限性**，以及苏木精和伊红（H&E）染色作为一种更方便、更具成本效益的替代方法的潜力。

2-1：LUAD的背景

LUAD是肺癌最常见的亚型，其发病率和死亡率都很高。对LUAD患者进行准确分层对个体化临床决策非常重要。肿瘤-结节-转移（TNM）分期系统用于风险分层和管理，但并不考虑肿瘤的异质性。

最新报告发现，TLS在抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。在黑色素瘤、肺癌和胃肠癌等多种癌症中，TLSs的增加与预后的改善相关。TLS有可能成为LUAD的辅助预后生物标志物。

2-2：目前TLS定量方法的局限性

以往的研究**大多使用多重免疫组化（mIHC）或免疫荧光（mIF），这两种方法不是常规检查方法，且成本较高，限制了其临床应用。相比之下，H&E染色**是组织病理学中应用最广泛、成本最低廉的技术。

2-3：TLS定量的自动化工作流程

目前已开发出**几种基于常规H&E染色WSI的TLS定量方法**。这些方法都是由病理学家手动评估，耗时长、依赖经验，而且可重复性差。随着计算机技术的快速发展，需要一种自动化和标准化的工作流程，以高效、准确地评估LUAD常规H&E染色WSI中的TLS。

2-4：研究目标

本研究旨在开发一种自动化工作流程，用于**量化H&E染色WSI上肿瘤区域的TLS密度**。使用三个独立的可切除LUAD患者数据集评估TLS密度的预后价值。

假设TLS密度是无病生存期（DFS）的一个独立预后因素，将其与临床病理变量相结合将改善预后分层。本研究旨在解决目前TLS定量方法的局限性，并探索自动化计算工作流程在改善LUAD患者预后评估方面的潜力。

三、结果

3-1：患者

本研究介绍了一项调查肺腺癌（LUAD）三级淋巴结构（TLS）预后价值的患者人群和研究设计。

患者人群

本研究**共收集了1196名可切除肺腺癌患者。802名患者符合纳入和排除标准**，这些患者被分为三个数据集：

训练集：来自广东省人民医院（GDPH）的322例患者。
外部验证集V1：中南大学湘雅二医院的226名患者。
外部验证集V2：山西省肿瘤医院134例患者和云南省肿瘤医院120例患者。

研究设计

中位随访时间

训练组	外部验证组V1	外部验证组V2
85.3个月	60.2个月	37.1个月

三个数据集的基线临床病理变量见表1，除性别和肿瘤部位外，三个数据集的所有临床病理变量均存在显著差异。

分析

该研究的患者群体具有多样性，来自不同医院的患者构成了发现集和外部验证集。不同数据集的中位随访时间各不相同，在解释结果时必须考虑到这一点，因为较长的随访时间可以更准确地评估疾病进展和生存情况。不同数据集在基线临床病理变量上的差异表明，患者群体可能具有不同的特征，这可能会影响研究结果。性别和肿瘤部位没有明显差异，表明这些因素在各数据集之间非常均衡。

启示

该研究设计了来自不同机构的多个数据集，为验证TLS密度在LUAD患者中的预后价值提供了可靠的方法。不同数据集之间临床病理变量的差异凸显了在解释结果时考虑患者异质性的重要性。使用随访时间不同的不同数据集可确保研究结果具有普遍性，并适用于更广泛的患者群体。

结论

该研究的患者群体和设计为LUAD患者TLS密度的预后价值提供了全面评估。研究结果一旦公布，将有助于人们了解TLS作为LUAD预后生物标志物的作用，并为临床决策提供参考。

3-2：分割结果和连续性分析

本研究内容讨论了用于量化肺腺癌（LUAD）三级淋巴结构（TLS）的自动计算工作流程与病理学家手动计数TLS的分割结果和一致性分析比较。

分割结果和一致性分析

本研究使用**Bland-Altman图评估了基于苏木精和伊红（H&E）染色的全切片图像（WSI）或免疫组化（IHC）染色的WSI的自动TLSs计数与人工TLSs计数之间的一致性**。

H&E染色WSIs的**类内相关系数（ICC）**为0.894（95% CI：0.821-0.938，p < 0.001），表明自动方法和手动方法之间的一致性很高。IHC染色WSI的ICC为0.903（95% CI：0.836-0.944，p < 0.001），也显示出高度的一致性。

H&E染色WSI上手动TLSs注释和自动TLSs分割的示例图片如下：

自动方法和人工方法在识别TLS方面具有良好的定性一致性。

分析

Bland-Altman图和ICC值表明，本研究中开发的自动计算工作流程与病理学家人工计数的TLS具有高度的一致性。对于H&E染色和IHC染色的WSI，两者的一致性都很高，这表明在TLSs评估中，自动化方法可以可靠地取代人工计数。观察到的强大定性一致性表明，自动化工作流程能正确识别TLS，这对其在临床实践和研究中的应用至关重要。

意义

分析结果验证了TLSs自动计数方法的准确性和可靠性。这种自动化工作流程现在可被视为人工TLSs计数的可靠替代方法，具有速度快、一致性好和潜在成本低的优势。自动方法克服了人工计数的局限性，如主观性和缺乏标准化，因此可促进TLSs评估在临床实践和研究中的广泛应用。

结论

研究的分割结果和一致性分析表明，用于量化LUAD患者TLSs的自动化计算工作流程与病理学家的人工计数高度一致。现在可以放心地使用这种自动化方法对LUAD患者的TLSs进行评估，支持将其纳入常规临床实践和研究中。

3-3：三级淋巴结密度的预后价值

本研究内容介绍了对肺腺癌（LUAD）患者三级淋巴结构（TLSs）密度的预后价值的研究结果。

TLS密度的预后价值

在发现集中，使用**最大选择秩统计法确定三级淋巴结构密度的临界值为每平方毫米0.489个三级淋巴结构。Kaplan-Meier曲线显示，在发现集和两个外部验证集中，TLS密度低的患者的无病生存期（DFS）明显低于TLS密度高的患者**。

将TLS密度与TNM分期相结合后，三个数据集中LUAD患者的风险分层变得更加精细。在三个数据集中，TLS高组的肿瘤区域内淋巴细胞密度明显高于TLS低组。在三个数据集中，TLS密度低与免疫抑制表型明显相关。

在**单变量分析中，性别、吸烟状况、TNM分期、分化分级、内脏胸膜侵犯（VPI）、淋巴管侵犯（LVI）、辅助化疗、免疫表型和TLS密度被作为多变量分析的候选因素。在多变量逐步Cox回归分析中，TLS密度被证明是发现集和两个外部验证集中DFS的独立预后因素。在对单变量分析中p值小于0.05的因素进行调整后，TLS密度在三个数据集中的p值仍小于0.05，进一步表明TLS密度是DFS的独立预后因素**。

亚组分析显示，对于早期（I-II期）或TNM I期的LUAD患者，TLS高密度组的DFS明显优于TLS低密度组。除按家族史、手术类型、表皮生长因子受体（EGFR）和ALK分层的亚组外，按临床病理变量分层的大多数亚组也观察到类似趋势。

分析

该研究表明，TLS密度是LUAD患者DFS的重要预后因素，不受其他临床病理变量的影响。自动TLS密度评估方法与人工计数方法一致，验证了其准确性和可靠性。在测试集和两个外部验证集中，TLS密度的预后价值是一致的，这表明它具有普适性。研究结果表明，TLS密度可作为一种有价值的生物标志物，用于LUAD患者的预后分层和治疗规划。还需要进一步的研究来验证这些发现，并探索TLS密度在LUAD患者临床实践中的潜在用途。

3-4：预测模型的开发与验证

本研究内容讨论了基于独立预后因素的肺腺癌（LUAD）患者无病生存期（DFS）预测模型的开发和验证。

预测模型的开发

根据发现集中确定的独立预后因素（吸烟状况、分化级别、TNM分期、淋巴管侵犯（LVI）和TLS密度），建立了预测DFS的Cox比例危险模型（完整模型）。

另外还建立了**四个参考模型**进行比较：

TNM分期模型
TLS密度模型
TNM分期和TLS密度模型
临床模型（吸烟状况、分化等级、TNM分期和LVI）

每个预测模型的编码、回归系数和估计的5年基线危险度汇总于下表。

预测模型的验证

在三个数据集（发现集和两个外部验证集）中对五个模型的性能进行了评估。在发现集和两个外部验证集中，完整模型比临床模型显示出更好的区分度和校准性。使用一致性指数（C-index）、曲线下综合面积（iAUC）、阿凯克信息准则（AIC）和似然比检验（LRT）对完整模型、TNM分期和TLS密度模型以及临床模型进行了比较。

在三个数据集中，与临床模型相比，完整模型在大多数时间点的预测性能更好：

分析

完整模型的开发包含了多种预后因素，展示了一种更全面的方法来预测LUAD患者的DFS。全模型优于临床模型的表现表明，额外的预后因素（TLS密度、分化分级和LVI）提供了传统临床病理变量无法捕捉的宝贵信息。来自不同机构的三个数据集对该模型的验证进一步证明了该模型的通用性和可靠性。该研究强调了整合多种预后因素以提高LUAD患者DFS预测准确性的重要性。

研究意义

该研究提供了一个经过验证的LUAD患者DFS预测模型，可用于指导临床决策和治疗计划。完整模型的性能有所提高，有助于识别疾病进展风险较高的患者，并据此制定治疗策略。未来的研究重点是完善该模型，研究TLS密度和其他预后因素在预测临床结果中的作用。

结论

该研究成功开发并验证了一个LUAD患者DFS预测模型，该模型结合了包括TLS密度在内的多种预后因素。完整模型的性能优于临床模型和其他参考模型，表明其具有临床应用潜力。研究结果强调了使用综合预后模型改善LUAD患者风险分层和治疗计划的重要性。

四、讨论

本研究内容讨论了研究结果及其对肺腺癌（LUAD）预后预测的影响。

可切除肺腺癌的准确预后预测

准确的预后预测对于指导临床决策和改善LUAD患者的风险分层至关重要。三级淋巴结构（TLS）有望成为包括LUAD在内的多种癌症的预后生物标志物。

现有方法的局限性

由于缺乏客观、高效、准确的量化工作流程，现有评估LUAD中TLS的方法受到限制。人工评估TLS耗费大量人力，易受观察者之间差异的影响，而且依赖于非程序性方法，如多重免疫组化（mIHC）或免疫荧光（mIF），这些方法在临床环境中并不常用。

自动化工作流程开发

该研究开发了一种自动计算工作流程，用于量化常规苏木精和伊红（H&E）染色的LUAD全切片图像（WSI）中肿瘤区域的TLS密度。该工作流程利用迁移学习和基于斑块级分类标签的弱监督方法来进行**组织分割和分类**。

自动工作流程与基于H&E染色的WSIs（ICC = 0.894；p < 0.001）和IHC染色的WSIs（ICC = 0.903；p < 0.001）的人工TLS计数显示出良好的一致性，表明其可靠性和可重复性。

TLS密度的诊断价值

研究发现，TLS密度是可切除LUAD患者DFS的独立预后因素。将TLS密度与临床病理变量相结合，可进一步改善预后分层。

与以往研究的比较

以往关于肺癌TLS的研究大多采用人工定性方法或mIHC/mIF，这在临床实践中并不常见。本研究基于常规H&E染色WSI的自动化工作流程更容易获得，成本效益更高，因此更容易在临床实践中推广。

对个体化临床决策的意义

研究表明，量化的TLS密度是预测可切除LUAD DFS的可靠生物标志物。将TLS密度与临床病理变量相结合，可通过改善患者分层来指导个体化临床决策。

与免疫表型的关系

研究观察到，免疫表型为炎症的患者预后较好，而免疫凋亡表型的患者预后较差。TLS密度与免疫表型之间的关联表明，TLS可能会促进炎症表型的免疫反应。

结论

该研究成功开发并验证了量化LUAD患者TLS密度的自动化计算工作流程。该自动化工作流程与人工计数显示出良好的一致性，更易于临床应用。量化的TLS密度是一种独立的预后生物标志物，具有良好的可靠性、可重复性和可推广性。将TLS密度与临床病理变量相结合，可以指导个体化临床决策，改善LUAD患者的分层。

本研究内容讨论了研究的局限性以及为解决这些局限性而制定的未来研究计划。

研究的局限性

作为一项回顾性研究，本研究存在固有的局限性，如选择偏差和有限的普遍性。本研究根据组织分割结果间接量化三级淋巴结构（TLS），由于TLS形态各异，这可能会带来一些偏差。自动TLSs计数方法与人工计数显示出良好的一致性，但间接量化方法仍有局限性。

未来研究计划

本研究的作者计划将来**在更大的前瞻性队列中验证TLS密度的预后价值。他们正在开发一种全自动工作流程，用于在苏木精和伊红（H&E）染色的全切片图像（WSI）上直接识别TLS，这有望提高TLS计数的准确性。他们还将根据TLS的成熟度将其分为不同类别（淋巴聚集、原发性滤泡和继发性滤泡），并评估它们对可切除肺腺癌（LUAD）患者预后影响的差异**。

分析

本研究的回顾性是医学研究中常见的局限性，因为它可能导致选择偏差和有限的外部有效性。不过，作者承认这一局限性，并计划通过前瞻性研究来解决这一问题。根据组织分割结果对TLS进行间接量化也是一个局限，因为这依赖于对TLS形态的假设，可能会带来误差。作者正在研究一种更直接的方法来识别TLS，这种方法应该能减少这种偏差。

自动和人工TLS计数之间的良好一致性令人欣慰，但并不能消除间接定量方法带来误差的可能性。全自动工作流程的开发是朝着克服这一局限性迈出的一步。根据TLS的成熟度对其进行分类并评估其预后效果，可为了解TLS在LUAD中的生物学意义提供有价值的见解。这种额外的分类可进一步完善预后模型。

意义

该研究的局限性突出表明，需要进行更大规模的前瞻性研究，并采用更直接的TLSs定量方法来验证研究结果。未来的研究计划表明，我们将致力于提高LUAD患者TLSs量化的准确性和可靠性。根据成熟度对TLSs进行额外分类可提供新的生物标志物，并有助于深入了解TLSs在LUAD中的预后和生物学作用。

结论

本研究的局限性强调了在更大规模的前瞻性队列中使用更直接、更精细的TLSs定量方法复制和扩展研究结果的重要性。未来的研究计划为克服这些局限性、提高TLS密度作为LUAD生物标志物的预测能力指明了道路。

五、实验模型和研究参与者详情

5-1：患者

本研究内容概述了一项关于肺腺癌（LUAD）三级淋巴结构（TLS）预后价值的回顾性研究的患者人群和研究设计。

患者人群和研究设计

本研究对象包括来自中国**不同地区四家医疗机构的可切除肺腺癌患者：（时间跨度为2007年至2020年**）

广东省人民医院（GDPH）	中南大学湘雅二医院（XYSH）
山西省肿瘤医院（SXCH）	云南省肿瘤医院（YNCH）

这项多中心研究获得了四家医院伦理委员会的批准（批准号：KY-Q-2022-338-01）。回顾性图像分析研究无需知情同意。

无病生存期（DFS）被定义为从手术到复发或死亡的时间间隔，是研究的终点。

**基线和临床病理变量**由医疗信息系统收集，包括：

手术年龄	性别	吸烟状况	家族史
肿瘤部位	分化等级	TNM分期	内脏胸膜侵犯（VPI）
淋巴管侵犯（LVI）	手术类型	表皮生长因子受体（EGFR）	ALK；辅助化疗

排除：

临床病理变量缺失	接受新辅助治疗
R1/R2切除术	其他恶性肿瘤病史

分析

多中心的研究设计，患者来自中国不同的医疗机构，增强了研究结果的普遍性。在医学研究中，当研究涉及对现有数据的分析，且对患者造成的风险最小时，采用放弃知情同意的回顾性研究设计很常见。

排除标准确保了研究人群的同质性，降低了混杂因素影响结果的风险。临床病理变量的全面收集为分析提供了丰富的数据集，从而可以详细研究TLS密度与DFS之间的关系。

意义

该研究的患者群体和设计有助于对TLS密度在LUAD患者中的预后价值进行可靠分析。研究排除了数据缺失的患者、接受新辅助治疗的患者或切除不完全的患者，确保了研究结果的有效性和可靠性。研究结果有望为LUAD患者的临床决策和治疗计划提供参考，尤其是那些可切除疾病的患者。

结论

该研究的患者群体和设计非常适合研究TLS密度在LUAD患者中的预后价值。全面的数据集和排除标准增强了这项研究的优势，并有可能得出具有普遍意义的研究结果。未来的研究可以通过更直接的TLSs定量方法，在更大规模的前瞻性队列中进一步验证这些发现。

5-2：组织切片数字化

本研究内容讨论了从苏木精和伊红（H&E）以及免疫组化（IHC）染色的肺腺癌（LUAD）患者诊断切片中获取数字化全切片图像（WSI）并对其进行质量控制的过程。

组织切片数字化

本研究使用**三种不同的扫描仪**从原发肿瘤的H&E染色诊断切片中获取数字WSI。

徕卡Aperio-AT2扫描仪	徕卡Aperio-GT450扫描仪	Hamamatsu扫描仪
广东省人民医院（GDPH）和云南省肿瘤医院（YNCH）	中南大学湘雅二医院（XYSH）	山西省肿瘤医院（SXCH）

此外，还使用Leica Aperio-AT2扫描仪（美国，0.252毫米/像素）以403倍的放大率对GDPH中CD3（T细胞的标记物）染色的相邻玻片进行了数字化处理。

图像质量由一名经验丰富的病理学家（B.B.L.）在不了解患者临床信息的情况下进行审核。模糊、含有伪影、染色不佳或缺乏足够肿瘤组织的WSI均被排除在外。

分析

使用三种不同像素分辨率的扫描仪表明，数据集的多样性可能会带来不同的图像质量。由经验丰富的病理学家参与图像质量审查，可**确保只有高质量的图像才会被纳入研究**，从而降低偏差和错误的风险。排除图像质量差或肿瘤组织不足的WSI对保持分析的准确性和可靠性非常重要。

影响

在数字WSI采集和审查过程中实施的质量控制措施有助于提高研究的有效性和结果的可靠性。H&E和CD3染色切片的使用为分析提供了全面的数据集，有可能增强研究的预后模型。多中心方法和不同类型的扫描仪可能会导致图像质量的差异，这可能需要在分析中加以考虑。

结论

该研究采用多台扫描仪和质量控制措施对组织切片进行数字化处理，这种方法的优点是可以确保纳入高质量的图像进行分析。排除低质量图像和缺乏足够肿瘤组织的图像对于结果的准确性和预后模型的可靠性至关重要。未来的研究可以**重点关注扫描仪类型和图像质量对使用数字WSI的研究分析和结果的影响**。

六、方法细节

6-1：组织和细胞分割与分类

本研究内容概述了该研究用于分析肺腺癌（LUAD）患者的组织和细胞分割与分类方法。

组织和细胞分割与分类

本研究采用与作者之前的工作类似的策略，对肿瘤区域进行**半自动分割。为了减少注释量，研究人员在Camelyon16数据集上利用迁移学习训练了一个ResNet50模型。利用广东省人民医院（GDPH）提供的LUAD全切片图像（WSI）注释对模型进行了微调。微调后的模型用于对四家参与医院的所有WSI进行肿瘤区域分割**。

病理学家（B.B.L.）对分割掩膜进行了**目测检查，并对不完美的掩膜进行了人工修正。肿瘤区域的组织分割是使用基于斑块级分类标签的弱监督语义分割方法进行的。该方法在103倍放大率下将肿瘤区域分为肿瘤上皮、肿瘤基质和淋巴细胞聚集。使用Hover-Net**对放大到403倍的肿瘤区域内的细胞进行分割和分类。

细胞分为肿瘤细胞、基质细胞、淋巴细胞和其他细胞。对癌症上皮、基质和整个肿瘤区域内的淋巴细胞密度进行量化，以**确定三种免疫表型**（炎症、免疫排斥和免疫惰性）。

分析

在特定数据集上使用迁移学习和微调表明，该模型的训练重点是与LUAD相关的数据。病理学家参与目视检查和手动校正分割掩膜，为自动流程增加了质量控制水平。弱监督语义分割方法减少了大量人工标注的需要，而人工标注既耗费人力，又容易出现变异。Hover-Net能够以更高的放大倍率对细胞进行分割和分类，从而对肿瘤区域内的细胞组成进行更详细的分析。根据淋巴细胞密度对免疫表型进行量化是一种新方法，可深入了解肿瘤微环境中的免疫反应。

应用

研究中使用的半自动分割和分类方法有可能提高分析LUAD组织样本的效率和准确性。自动和人工审核流程的整合确保了自动分割结果的高质量。根据细胞密度识别免疫表型，可以更好地了解肿瘤微环境及其对预后的影响。

结论

该研究的组织和细胞分割与分类方法展示了先进计算方法在LUAD患者数据分析中的应用。自动和人工审查过程的结合确保了分割结果的可靠性。根据细胞密度识别免疫表型是这项研究的一个新颖之处，有助于了解免疫细胞组成在LUAD中的预后价值。

6-2：TLS 密度量化

本研究内容介绍了肺腺癌（LUAD）患者三级淋巴结构（TLS）密度的量化程序。

TLS密度量化程序

首先计算每张全切片图像（WSI）的**肿瘤区域面积，以此量化三级淋巴结构密度。利用该面积排除直径（或椭圆主轴）小于150毫米的淋巴聚集体，最终得到TLS的分割掩膜**。

TLS密度被定义为肿瘤区域内TLS数量与肿瘤区域面积之比。为了确定发现集中TLS密度的**临界值，采用了最大选择秩统计法。TLS密度小于临界值的患者被归类为TLS-低，TLS密度大于或等于临界值的患者被归类为TLS-高**。

一致性分析

为了评估人工TLS计数与自动TLS计数之间的一致性，我们随机选取了50例H&E染色的WSI和50例IHC染色的WSI。

一位经验丰富的病理学家（B.B.L.）使用**Aperio ImageScope（12.3.2版）**在这些选定的WSI上手动识别TLS，并确定每个WSI肿瘤区域的TLS计数。

使用类内相关系数（ICC）和Bland-Altman图来评估基于H&E染色WSI或IHC染色WSI的人工TLS计数与使用本研究开发的定量方法进行的自动TLS计数之间的一致性。

分析

TLS密度的量化过程简单明了，依赖于对肿瘤区域和TLS的准确分割。使用最大选择秩统计法确定截断值可确保截断值是基于数据而不是任意的。一致性分析对于验证自动TLS计数方法与人工计数黄金标准的一致性非常重要。通过ICC和Bland-Altman图评估人工和自动TLS计数之间的一致性，表明了自动方法的可靠性和准确性。

意义

TLS密度的量化程序对于将其用作LUAD患者的预后生物标志物至关重要。一致性分析表明，自动TLS计数方法可以可靠地取代人工计数，从而有可能减少观察者之间的差异，提高TLS评估的效率。研究结果表明，在预后研究和临床实践中可以放心使用自动TLS计数方法。

结论

该研究开发了一种可靠而准确的方法，用于量化LUAD患者的TLS密度。结果表明，自动TLS计数法与人工计数法有很好的一致性，表明其有潜力用于常规临床。一致性分析支持使用自动方法对LUAD患者的TLS密度进行量化。

七、量化和统计分析

本研究内容介绍了研究中使用的统计分析方法，以评估从肺腺癌（LUAD）患者及其三级淋巴结构（TLS）密度中收集的数据。

统计分析方法

分类数据以计数（百分比）形式报告。使用皮尔逊卡方检验比较三个数据集之间的差异。

反向卡普兰-梅耶法**估算随访中位数**。
对数秩检验用于**估算TLS低组和TLS高组之间无病生存期（DFS）的差异**。
Wilcoxon秩和检验用于**比较TLS高组和TLS低组肿瘤区域内淋巴细胞密度的分布情况**。
Cochran-Armitage趋势检验用于**分析TLS密度与免疫表型之间的关联**。

在单变量Cox回归分析中使用**Wald检验评估了TLS密度和其他临床变量的预后能力**。在单变量分析中具有统计学意义（P值小于0.05）的变量被保留用于多变量分析。

基于Akaike信息准则（AIC）的多变量逐步Cox回归分析用于**确定DFS的最佳预测模型。使用Harrell’s C-index和综合曲线下面积（iAUC）（1000次引导重采样）衡量预测模型的判别能力。模型校准通过AIC进行评估。预测5年DFS的准确性通过与时间相关的接收者操作特征曲线（ROC）和曲线下面积曲线（AUC）进行测量。采用似然比检验（LRT）来确定模型之间的差异是否显著**。对于单变量分析中P<0.05的所有变量，也采用了无逐步回归的多变量分析。

软件和显著性水平

所有统计分析均使用R软件（4.1.2版，www.R-project.org）进行，软件包包括survival、survminer、lmtest、risksetROC和vioplot。P<0.05（双尾）被认为具有统计学意义。

分析

研究中使用的统计方法适合研究设计和收集的数据类型。使用**皮尔逊卡方检验、对数秩检验和Wilcoxon秩和检验可对组间的分类数据和连续数据进行比较。Cochran-Armitage趋势检验适用于分析随着时间推移或暴露于某一风险因素的程度增加而出现的趋势。多变量逐步Cox回归分析、C指数、iAUC和AIC适用于评估TLS密度和其他变量在LUAD患者中的预后价值。LRT**用于比较不同模型的性能，确保差异具有统计学意义。R软件及其软件包的使用体现了作者在统计分析方面的熟练程度，以及他们对透明度和可复制性的承诺。