【医学AI顶刊·05-23解读】癌症免疫新视角：三级淋巴结(TLS) 作为预后生物标志物的潜力与挑战

小罗碎碎念

昨天的推文给大家分享了6篇关于AI与三级淋巴结交叉的文献概述。

【医学AI顶刊·05-22速递】探索癌症预后的新方向：AI与三级淋巴结的结合

今天要仔细分析的这篇文章，与AI结合的部分并不多，为什么要先选它呢？主要的原因是想让大家先了解一下三级淋巴结的临床背景，这样后续在阅读与AI交叉的文章时，能更好的理解作者为何要如此设计课题。

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文献概述

这篇文章是关于三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures, TLS）在肿瘤免疫中的作用和其在临床应用中的前景的综述。

文章首先介绍了TLS的基本概念，它们是类似二级淋巴器官（Secondary Lymphoid Organs, SLOs）的免疫细胞群聚体，具有相似的功能。TLS在大多数癌症类型中通常与抗肿瘤免疫反应相关，但有时也表现为促肿瘤免疫反应。TLS功能的异质性主要由肿瘤浸润性淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）的组成以及肿瘤相关TLS（Tumor-Associated Tertiary Lymphoid Structures, TA-TLS）中细胞亚群的平衡决定。TLS的成熟度、密度和位置的不同可能对肿瘤免疫产生相反的效果。成熟度和/或密度较高的TLS通常与有利的临床结果和免疫治疗反应相关，这主要是由于TA-TLS中不同免疫细胞亚群之间的交流。

文章进一步讨论了TLS的成熟TLS的形成和特征，包括TLS的组成、TLS的形成和成熟过程，以及TLS内免疫细胞的相互作用如何促进抗肿瘤免疫。TLS的形成和成熟依赖于不同细胞类型之间的复杂配体-受体相互作用，包括先天淋巴细胞、基质细胞、内皮细胞和B细胞。成熟的TLS与癌症中的积极抗肿瘤免疫反应有关，但TLS在癌症免疫景观中的作用是多样的，并非所有TLS都积极参与对抗癌症的免疫反应。TLS的成熟是一个多阶段过程，其特征是不同的结构和功能阶段。

文章还探讨了TLS作为肿瘤预后生物标志物的潜力，以及用于TLS检测和定量分析的当前常规方法。研究者们正在探索结合成像特征和先进的学习模型以及数字病理学来增强TLS的可视化。此外，文章还讨论了在体内诱导TLS的临床前策略及其应用前景，包括使用细胞因子或趋化因子、化疗、放疗、癌症疫苗和免疫检查点阻断（ICB）治疗等方法。

最后，文章总结了TLS在肿瘤免疫中的双重作用，即所谓的“双刃剑”效应，这可能更依赖于TLS中不同免疫细胞亚群的比例。文章强调了未来TLS发展的两个主要方面：

• 一是解决TLS异质性带来的量化和评估困难；
• 二是有效诱导肿瘤中TLS的发生和成熟。

文章提出，通过结合特定的TLS标记、成像技术和人工智能在组织病理学中的应用，可能为TLS的检测和定量分析开辟新途径。此外，使用新型生物材料等复杂技术来生成可诱导的TLS正在被探索，并在临床前模型中显示出非常有希望的结果。然而，将这些技术工具转化为临床实践仍然需要解决组织安全性、成本控制和选择合适的人体化体内模型等问题。这对于指导TLS在免疫治疗和预后中的进一步精准和效率至关重要。

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一、引言

有效的抗肿瘤免疫需要肿瘤浸润淋巴细胞的参与。特别是三级淋巴结构（TLS）的识别，作为组织良好的TIL集群，能够引发延迟的免疫应答[1]。

TLS类似于次级淋巴器官（SLO）的免疫细胞簇，在出生后非淋巴组织中形成，通常在正常生理条件下不存在，主要在慢性炎症条件下显现，包括癌症、慢性感染和自身免疫疾病[1, 2]。慢性炎症背景与肿瘤发展密切相关。对淋巴细胞浸润和TLS在结直肠癌（CRC）、非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌（BC）和黑色素瘤患者的肿瘤微环境（TME）中的空间聚集的分析表明，患者的预后与淋巴细胞的浸润程度、密度和成熟度正相关[3-6]。

评估不同肿瘤类型中TLS的成熟度对于将TLS建立为肿瘤学中一个可靠的预后工具至关重要。此外，诱导癌症患者TLS的更高密度和成熟度有助于增强机体的抗肿瘤免疫。进一步地，促进癌症患者TLS的更高密度和成熟度，可以显著提升机体的抗肿瘤免疫反应。

在过去的几十年里，针对免疫检查点——特别是程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、其配体程序性死亡配体1（PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的免疫治疗，已成为对抗多种实体肿瘤的关键策略。然而，免疫检查点阻断（ICB）面临挑战，包括临床应用限制和安全性问题，可能导致炎症副作用或免疫相关不良事件（irAEs）[7, 8]。

肿瘤内TLS已被认为是能够预测并可能增强ICB治疗效果的生物标志物[9, 10]。肿瘤内TLS的分析显示，无论PD-L1表达状态如何，都与患者的临床益处正相关，这为ICB治疗患者选择中新的标志物的使用提供了便利[11]。纳米颗粒在多模态和分子成像中的独特特性使其能够用于体内生物发生的极其精细的非侵入式多模态成像[12]。开发更高效、非侵入式的TLS可视化和诱导技术代表了一种新的研究方向[13]。

在本综述中，作者概述了TLS的组织和细胞结构，并探讨了TLS形成和成熟过程中涉及的途径和分子机制。描述了TLS内免疫细胞相互作用对抗肿瘤免疫的双重影响，并强调了TLS作为癌症生物标志物的潜力。最后，总结了TLS的当前诱导策略，并讨论了其未来发展的困境和解决方案。

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二、成熟TLS的发展与特征化

鉴于成熟TLS对肿瘤预后和治疗的影响，理解成熟TLS内部组织和细胞结构中免疫细胞相互作用的机制对于后续的抗肿瘤免疫反应至关重要。此外，了解TLS形成和成熟过程中的关键作用机制也是必要的。

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2-1：成熟TLS的组成

成熟的三级淋巴结构（TLS）是位于淋巴滤泡内的一个区域，由CD20+B细胞形成，周围环绕着CD3+T细胞。这种结构类似于次级淋巴器官（SLO）。它主要由T细胞、B细胞、滤泡树突细胞（FDCs）、树突细胞（DCs）、基质细胞、巨噬细胞、内皮细胞和高内皮静脉（HEVs）组成。

目前，TLS内的T细胞区域已被广泛研究，被认为是预测临床结果的生物标志物[14, 15]。通过对39例肝内胆管癌（iCCA）样本进行多重免疫组化（mIHC）分析TLS的组成，发现TLS的空间分布和丰富度与预后显著相关，滤泡辅助T细胞（Tfh）和调节性T细胞（Treg）可能在决定空间上不同TLS的功能定位中发挥关键作用[16]。

B细胞在肿瘤免疫中的作用已成为近期研究的焦点[9, 17, 18]。通过应用单细胞技术、免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）分析，已识别出具有不同表型标记的独特B细胞亚群，这些标记已达成普遍共识，并且发现许多表型在肿瘤预后中发挥不同的作用[19]。然而，需要注意的是，B细胞在TLS内的功能受到TLS成熟程度的影响。

为了实现完整的抗肿瘤免疫反应，免疫球蛋白类别转换和亲和力成熟是必要的。Ayana T Ruffin及其同事证明了在人类乳头瘤病毒（HPV）诱导的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中，肿瘤浸润B细胞（TIL-B）的转录谱以及与生发中心（GCs）相容的TLS免疫细胞的空间组织与患者良好的预后显著相关[20]。

在HPV HNSCC的小鼠模型中诱导TLS被发现可以增强对PD-1阻断疗法的反应，而这种反应通过消除CD20+B细胞而减弱。这些研究表明，改善TIL-B细胞反应可能作为T细胞介导免疫疗法的补充方法。关于T细胞和B细胞在TLS中对抗肿瘤作用的新想法和研究方向具有潜力。重点是探索成熟TLS中免疫细胞相互作用的潜在机制。

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2-2：TLS的形成与成熟

TLS与SLO具有相似性，这使得通过探索SLO的发展过程来研究TLS成为可能。

由于不同的组织来源和疾病状态，参与TLS启动和发展过程的细胞成分和分子途径有所不同，其固有的功能属性也与SLO不同（图1a；表1）[21]。

(a) TLS 的初始形成过程：

• 在炎症发生的地方，促炎分子和趋化因子的局部累积可以招募淋巴组织诱导（LTi）细胞。
• LTi 细胞与局部淋巴组织组织者（LTo）细胞相互作用，启动多种细胞因子（如 IL-7、IL-17 和 RANKL）和细胞因子受体（如 IL-7R、IL-17R 和 RANK）的表达，从而开始 TLS 的发展。
• 许多免疫细胞可以取代 LTi 细胞，例如 T 辅助 17（Th17）细胞、CD8+T 细胞、B 细胞、M1 型极化的巨噬细胞、先天淋巴细胞-3（ILC3）和自然杀伤细胞。
• 同样，癌症相关的成纤维细胞（CAF）、血管平滑肌细胞（VAMC）和脂肪细胞可以取代 LTo 细胞。
• 淋巴毒素 α1β2（LTα1β2）与淋巴毒素 β 受体（LTβR）结合，这一信号通路促进血管内皮生长因子 A（VEGFA）和血管内皮生长因子 C（VEGFC）的分泌，以促进高内皮细胞（HEV）的发展。
• 该通路还可以促进用于招募免疫细胞的粘附分子的分泌，如血管粘附分子 1（VCAM 1）、细胞间粘附分子 1（ICAM1）和粘膜血管地址素细胞粘附分子 1（MADCAM 1）以及趋化因子（CCL19、CCL21、CXCL12 和 CXCL13）。
• 这些趋化因子诱导淋巴细胞上的 LTα1β2 表达，从附近的 HEVs 招募淋巴细胞进入 TLS，并形成 T 细胞和 B 细胞区域。

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1. 例子：

   • SLOs：脾脏、区域淋巴结、Peyer氏斑、孤立淋巴滤泡（ILFs）、扁桃体和鼻腔相关淋巴组织（NALT）。
   • TLS：通常与慢性感染、自身免疫疾病、移植排斥和癌症相关。

2. 起源：

   • SLOs：在胚胎发育期间形成。
   • TLS：在出生后形成，通常与特定病理条件相关。

3. 诱导和发展：

   • SLOs：涉及淋巴组织组织者（LTo, FAP+podoplanin+, LTβR+）、淋巴组织诱导器（LTi）、内皮细胞和视黄酸。
   • TLS：涉及LTo（FAP+podoplanin+, LTβR+）、ILC3/LTi、内皮细胞、NKT、Th17、慢性炎症、细胞因子（如淋巴毒素LT、肿瘤坏死因子TNF、LIGHT、IL-17）和趋化因子（如CXCL13, CCL19, CCL21）。

4. 位置：

   • SLOs：位置相对固定，不会改变。
   • TLS：位置可变，可在非淋巴器官或组织部位形成。

5. 结构：

   • SLOs：具有明确的B细胞和T细胞区域、高内皮细胞（HEVs）和淋巴管。
   • TLS：结构可变，从混合的T细胞和B细胞到具有T细胞和B细胞区域的结构，也包含HEVs和淋巴管。

6. 被膜：

   • SLOs：具有明确的被膜。
   • TLS：很少或没有明确的被膜。

7. 自我耐受：

   • SLOs：维持自我耐受。
   • TLS：自我耐受可能受到干扰，可能导致自身抗体的产生。

8. 持久性：

   • SLOs：通常是永久性的，但可以崩溃。
   • TLS：通常是暂时性的。

这些特点突出了SLOs和TLS在发育、结构、功能和病理学上的不同。二级淋巴器官是免疫系统组织化和功能的关键部分，而三级淋巴结构则是在特定病理条件下形成，可能与慢性炎症和免疫反应的局部调节有关。这种比较有助于我们理解这两种淋巴结构在健康和疾病中的不同作用和重要性。

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TLS的形成依赖于不同细胞类型之间的复杂配体-受体相互作用，包括固有淋巴细胞（ILCs）、基质细胞、内皮细胞和B细胞。CD3-CD4-/+ CXCR5IL-7Rα+hi ILCs，也称为淋巴组织诱导细胞（LTi），是SLO发展的关键组成部分[22]。表达podoplanin和fibroblast activation protein-α (FAP)的基质成纤维细胞已被证明与小鼠和人类模型中TLS的形成有关[23, 24]。成纤维细胞分泌的IL-7和CXCL13招募并诱导LTi细胞增殖和扩展，有助于SLO的发展。随后，LTi细胞分泌的淋巴毒素α1β2（LTα1β2）诱导淋巴组织形成细胞（LTo）的成熟，导致CXCL13、CCL19和CCL21的上调，从而促进B细胞和T细胞渗透到TLS中[9, 25, 26]。

此外，高内皮静脉（HEVs）通过促进肿瘤内淋巴细胞的聚集和渗透，参与TLS成熟的过程，为TLS的进一步成熟创造了有利环境[27]。TLS成熟后，激活的免疫细胞通过HEVs从TLS转移到肿瘤床，从而对癌细胞产生强大的抗肿瘤免疫[28]。

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成熟的TLS通常与癌症中积极的抗肿瘤免疫反应相关联

TLS在癌症免疫微环境中的作用各不相同，并非所有TLS都积极参与对抗癌症的免疫反应。这种变异性可能归因于TLS密度和成熟度的差异，这些差异影响了它们的结构组成和细胞组成。

(b) TLS 的成熟阶段：

• TLS 的成熟经历三个阶段的演变。
• 从松散的淋巴细胞聚集体发展到带有巨噬细胞和树突细胞（DCs）的 T 细胞和 B 细胞初级滤泡，
• 到包含生发中心（GCs）、宿主细胞、高内皮细胞（HEVs）和淋巴管（LVs）的成熟极化结构。

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TLS的成熟是一个多阶段过程，具有不同的结构和功能阶段（图1b）。不成熟的TLS，也称为早期TLS（E-TLS），代表初始阶段，由松散聚集的T细胞、B细胞和基质细胞组成。这些早期结构作为基础，招募额外的免疫细胞，并响应由基质或淋巴细胞分泌的化学因子和细胞因子（例如CXCL13、CXCL12、TNF-α、IL-17）而演变成更组织化的形式[25, 46]。由此产生的初级滤泡样TLS（PFL-TLS）具有被T细胞包围的B细胞簇和滤泡DC，但缺乏生发中心（GCs）[25]。过渡到次级滤泡样TLS（SFL-TLS）标志着最后的成熟阶段，主要特征是GC活动的出现。

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成熟的TLS也表现出与肿瘤的不同位置关系（图1c）。

© TLS 在体内的定位：

• TLS 在人体的定位包括基质内、肿瘤周围和肿瘤内部。
• 图中还提到了一些细胞因子的缩写，例如 IL-7（白细胞介素-7）、RANK（核因子 κB 受体激活剂）、RANKL（核因子 κB 配体受体激活剂）、CCL19（C-C 基序趋化因子 19）、CXCL12（C-X-C 基序趋化因子 12）。

尽管有这些分类，E-TLS在诱导抗肿瘤反应方面的有效性尚未得到证实，TA-TLS的存在并不保证产生有益的免疫反应。现有证据表明，只有具有GCs的TLS在对抗肿瘤方面才是功能性的[47]。

进一步的研究揭示了这种复杂性。对127个早期肝病变的病理和基因表达分析显示，24%的样本表现出E-TLS，并且这些与免疫抑制和免疫缺陷基因的高表达明显相关，这些基因不能阻止进展为肝细胞癌（HCC），似乎有利于免疫逃逸[48]。

在另一项涉及273名HCC患者的研究中，结果表明早期肿瘤复发的风险与肿瘤内TLS的存在以及成熟度水平有关[49]。值得注意的是，肿瘤内成熟TLS的存在显著提高了周围型胆管癌患者的总体生存率。这一结果与E-TLS或PFL-TLS存在时观察到的影响形成鲜明对比，突显了TLS成熟度在患者预后中的关键作用[50]。

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2-3：TLS中的细胞间相互作用促进抗肿瘤免疫

先前的研究已经强调，在广泛的实体肿瘤中，TILs的高密度与有利的临床结果相关联，这突显了基于TIL的方法的治疗潜力[51, 52]。

在TIL阳性肿瘤的环境中，成熟的TLS成为复杂免疫细胞相互作用的关键场所[53]。在活跃的TLS微环境中，这些相互作用不仅促进初始或记忆免疫细胞的（重新）激活，还促进效应细胞的扩展，这一过程超过了TILs在肿瘤床中无方向性线索导航的能力。

尽管存在这些有益的动态，TLS内调节细胞的积累可能会抑制免疫反应，导致TLS的潜在失活或休眠[54]。然而，当TLS内的免疫细胞协同工作时，尤其是当B细胞产生肿瘤特异性抗体并且细胞毒性T淋巴细胞被激活时，它们能够协调强大的抗肿瘤免疫，从而显著改善患者的预后（图2）[19]。

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Fig. 2 描述了第三级淋巴结构（TLS）在肿瘤免疫中的双重作用，包括它们在促进和抑制肿瘤生长中的潜在角色。

(a) TLS中的抗肿瘤免疫效应：

• 在TLS的生发中心（GC）内，生发中心B细胞（GC B cells）在接受到来自滤泡树突细胞（FDCs）的抗原传递并与T滤泡辅助细胞（Tfh）相互作用后，分化为记忆B细胞和浆细胞（PCs）。
• 在T细胞区域，分化的B细胞和树突细胞（DCs）向效应T细胞呈递抗原肽，促进效应T细胞浸润到肿瘤床。
• 浆细胞沿着成纤维细胞的轨迹进入肿瘤床，并产生抗肿瘤IgG抗体。
• 在肿瘤中，记忆B细胞可以通过表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）或释放颗粒酶B来破坏肿瘤细胞。
• 自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞上的Fc受体可以与抗肿瘤抗体的恒定区结合，并通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）来破坏肿瘤细胞。

(b) TLS中的肿瘤促进效应：

• IgA浆细胞与分泌抑制性细胞因子相关，这些因子创造了一个免疫抑制环境，有利于M2型巨噬细胞、髓源性抑制细胞（MDSC）、调节性T细胞（Treg）和B调节细胞（Breg）的出现，同时抑制效应T细胞的功能。
• Th2细胞分别产生IL-4和IL-13，这些细胞因子通过增加表皮生长因子的表达促进肿瘤进入循环系统，并通过增加MDSC产生的TGF-β间接抑制效应T细胞的功能。
• 巨噬细胞上调PD-L1以在ADCP后支持局部免疫抑制。
• 巨噬细胞产生的补体成分1q（C1q）与覆盖IgG的肿瘤细胞结合，激活经典补体级联反应，促进肿瘤生长和血管生成。
• B细胞也产生VEGF，促进血管生成。

总的来说，Fig. 2 展示了TLS在肿瘤免疫中的复杂作用，它们可以通过多种免疫细胞的相互作用来促进抗肿瘤反应，同时也可能通过创造免疫抑制环境来促进肿瘤生长。这种平衡可能取决于多种因素，包括肿瘤类型、微环境和免疫细胞的特定表型。了解这些机制对于开发针对肿瘤微环境中TLS的免疫治疗策略至关重要。

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2-4：B细胞在TLS中作为抗原呈递细胞的多方面作用

作为抗原呈递细胞（APCs），B细胞通过B细胞受体（BCRs）与特定抗原特异性相互作用，激活并增殖为浆细胞（PCs），启动导致抗原内化的信号级联[55]。

在TLS内，B细胞能够将内化和处理的抗原与主要组织相容性复合物（MHC）II分子结合，通过BCR呈递给CD4+T细胞，触发其激活[52]。

在卵巢癌中，B细胞展示了通过MHC I分子将抗原肽呈递给CD8+T细胞的能力，表明MHC I的抗原呈递可能具有重大意义[56]。Rita Cabrita等人发现，TLS中的单个B细胞高表达MHC I和II类分子，这表明TLS中的B细胞在抗原呈递方面具有高效能力[57]。

此外，Sheng Hong等人利用RNA噬菌体Qβ衍生的病毒样颗粒作为模型抗原，证明特异性的抗原B细胞作为强大的APCs，能够激活初始CD4+T细胞，并促进其向T滤泡辅助细胞（Tfh）的分化[58]。

在NSCLC的研究中发现，肿瘤浸润B细胞在特定NSCLC患者中呈递抗原并激活CD4+T细胞。TIL-B表型的激活或耗竭与CD4+T细胞表型相关，并与NSCLC患者的临床结果改善相关，展示了TME激活的增加和TIL-B抗原呈递的增强[59]。

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2-5：B细胞分化为浆细胞用于抗体产生

近期研究表明，TLS内TIL-B和浆细胞（PCs）的高密度与各种癌症类型的改善临床结果之间存在显著相关性[60-62]。这些PC能够产生与肿瘤细胞结合的特异性抗体，这些抗体可以阻断肿瘤细胞上特定靶蛋白的活性，触发补体系统，并增强抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）[63]。

尽管尚不完全理解PC及其抗体在TLS中如何抑制癌症的确切机制，但已观察到在卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌（LUAD）和NSCLC中，TLS与活性生发中心相关的粘膜相关淋巴组织（MALT）的存在，并发现这些存在与改善患者的总生存率（OS）有关[64-67]。这一观察凸显了它们在增强抗肿瘤免疫中的关键作用。

胰腺导管腺癌

在胰腺导管腺癌（PDAC）手术标本的淋巴细胞浸润肿瘤中，发现了56%的具有活跃生发中心的粘膜相关淋巴组织。此外，限制区域表现出B细胞淋巴瘤6（BCL6）、CD21和Ki67的表达，这表明生发中心B细胞的体细胞高突变和亲和力成熟。

研究发现，TLS患者在肿瘤内和外周血中IgG表达B细胞的百分比有所增加。通过分析TLS内BCR序列，发现IgG1亚类重链是主要的类型，这表明在抗原识别过程中，TLS内的B细胞倾向于IgG1类别转换[68]。

此外，在PDAC的研究中发现，PDAC不仅含有成熟的TLS，增强T细胞功能并包含多种肿瘤反应性T细胞，而且还促进这些结构内的B细胞分化为PCs。这一过程归因于TGF-β信号传导、激活T细胞表达的CXCL13和TGF-β产生成纤维细胞的支持作用，这些因素共同促进B细胞激活和TLS的复杂发展[69]。

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非小细胞肺癌

在NSCLC中，Claire及其同事使用IHC检查了肿瘤内B细胞的分化水平。他们发现，所有存在于肿瘤中的B细胞都与它们在TLS中的原位组织相对应，这通过与SLOs的比较得到证实。

通过ELISA分析，NSCLC患者B细胞的上清液中发现了针对肿瘤抗原包括LAGE-1、MAGEA1、MAGEC2、TP53、NY-ESO-1和其他MAGE抗原的IgG和IgA抗体，这表明TLS可能是体液免疫反应的活跃位置[70]。

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透明细胞肾细胞癌

在透明细胞肾细胞癌（RCC）中，研究人员发现了所有导致PC形成的B细胞成熟阶段。PC相关基因MZB1以及免疫球蛋白基因IGHG1和IGHA1在TLS区域和远离TLS的肿瘤区域都显示出高表达水平[71]。这表明在TLS内，经过原位抗原驱动的B细胞激活后，部分抗体分泌的PC得以生成，并具有迁移到远处的能力。对PC和成纤维细胞的特定标记显示，前者与成纤维细胞的轨迹对齐并嵌入成纤维细胞网络中，在TLS区域内局部和远处都有[71]。这表明PC可以在肿瘤床内沿成纤维细胞路径远程传播（图2a）。

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卵巢癌

在卵巢癌中，TLS经常被密集浸润的PC包围，这些PC在肿瘤内产生抗体。它们对肿瘤相关抗原（TAAs）的靶向能力也已得到证实。

尽管Iglesia及其同事发现，通过评估11种癌症类型的几种发表的B细胞/PC谱，B细胞特征与胶质母细胞瘤和肾癌的总生存率呈负相关，但他们也指出，生物信息学方法仍存在局限性，因为不同的B细胞特征和其他免疫细胞特征通常在同一肿瘤类型中产生不同的预后结果[72]。

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2-6：T细胞发挥细胞毒性辅助功能

在抗肿瘤免疫反应中，抗原呈递细胞（APCs）从肿瘤组织中捕获肿瘤抗原，并迁移到引流淋巴结（DLNs），在那里它们将这些抗原呈递给T细胞，触发T细胞的激活[73]。

肿瘤浸润的TLS（TA-TLS）在TME内的恶性细胞附近形成，与远处的DLN相比，它们能够更直接和高效地激活T细胞[74]。APCs可以快速迁移到TLS，并向T细胞呈递抗原肽，TLS中的肿瘤抗原量可能超过肿瘤引流淋巴结（TDLN）中的量[75]。重要的是，Miao He等人的一项研究显示，NSCLC中TLS的成熟与患者术后复发的风险较低相关，而肿瘤浸润的TDLN减少了TLS的预后相关性[76]。

在TLS的B细胞区，生发中心B细胞与总TILs密切相关，这些TILs被Tfh TIL、T辅助1定向的CD4 TIL、TIL-B抗体分泌和长期生存所标记，这表明存在成熟的TLS[54, 77]。TIL-B的主要辅助细胞与Tfh TIL密切相关，通过表达CXCR5这一标记，CXCR5在TLS中各种肿瘤类型的抗肿瘤免疫反应中发挥着作用[78]。重要的是，通常位于B细胞滤泡内和附近的Tfh细胞对于B细胞的发育和生存至关重要。它们通过促进诱导性共刺激分子（如ICOS:ICOS配体（ICOSL）和CD40:CD40配体（CD40L））之间的相互作用，以及包括IL-10和IL-21在内的细胞因子，协同促进B细胞的激活和分化。这些相互作用随后增强了Bcl6的表达，从而稳定了Tfh细胞的表型[10, 79, 80]。这一机制与CRC小鼠模型的观察结果相符，在该模型中，Helicobacter hepaticus（Hhep）的引入导致肿瘤周围的TLS数量增加，由Tfh细胞驱动的CD4+T细胞反应发挥了关键作用。然而，Tfh细胞的缺失导致TLS消失和免疫细胞浸润减少[81]。因此，TLS内的功能性Tfh细胞对于有效激活GC B细胞并促进免疫球蛋白抗体的产生至关重要，同时还能诱导激活的CD8+T细胞表达IFN-γ和GZMB，从而激活并离开TLS[54]。

最近，研究人员在诱导肾损伤TLS的小鼠模型中发现了一种与年龄相关的两种淋巴细胞亚群——CD153PD-1CD4衰老相关T（SAT）细胞和CD30T-bet年龄相关B细胞（ABCs）。在这个模型中，CD153或CD30基因的缺失损害了SAT细胞的功能性诱导，并减少了ABC和GC B细胞的数量，从而影响了TLS的形成。

这项研究还验证了在人类中存在具有类似SAT基因表达和CD153/CD30信号通路的Tfh细胞[82]。此外，在老年小鼠的脾脏中，还观察到了与年龄相关的CD4+T细胞亚群，包括耗竭细胞（具有与SAT细胞相似的基因表达）、细胞毒性细胞和Treg细胞[83]。这表明，与年龄相关的免疫细胞功能变化可能对肾损伤以外的系统产生更广泛的影响，可能影响癌症免疫。

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2-7：在TLS中，生发中心调节性T（Tfr）细胞与B细胞相互作用促进肿瘤进展

在癌症免疫周期中，效应性T细胞与生发中心调节性T细胞（Tfr）之间的平衡比率至关重要，决定了癌症免疫的结果。

Tfr细胞，其特征为CD25+CXCR5+GARP+FOXP3+表型和去甲基化的叉头盒蛋白3（FOXP3）基因，通过多种信号通路分化，主要受FOXP3和Bcl-6的调控[50, 84]。Tfr细胞中的Bcl-6，这一关键转录因子也存在于Tfh细胞中，表明Tfr和Tfh细胞之间存在功能联系。

最近的研究表明，IL-2、STAT3和STAT5通路的激活有助于将记忆Tfh细胞转化为功能性Tfr细胞，靶向FOXP3和BCL6基因[85]。Tfr细胞产生高水平TGF-β，这显著抑制Tfh细胞的扩张、自身反应性B细胞的生发中心激活和自身抗体的产生[86, 87]。然而，小鼠研究已表明，IL-21通过抑制蛋白激酶B（Akt）磷酸化和减少TGF-β和Foxp3表达，阻碍Tfr细胞的发育[85]。因此，功能性Tfh细胞与Tfr细胞的比例决定了肿瘤免疫的多种影响[88]。

在乳腺癌（BC）中，Tfr细胞被观察到在TLS内抑制Tfh细胞的功能[54]。另一项研究确定了肿瘤浸润调节性T（Ti-Treg）细胞在BC肿瘤周围的显著存在，这些Ti-Treg细胞与患者的复发和死亡相关[89]。

在NSCLC患者中，TLS内迁移的Treg细胞显示出不良的预后价值，表明这些与TLS相关的Treg细胞积极抑制某些细胞如DCs、T和/或B细胞的免疫功能，这与肺肿瘤模型中的发现相呼应[90]。在NSCLC中，TLS-B细胞密度与DPP4基因表达呈负相关，DPP4基因是一种参与TCR介导的T细胞共激活和Treg介导的TIL CD4+T细胞免疫抑制的受体[67]。在早期肺癌中，观察到Tfr细胞在TLS内的富集和浸润，Tfr细胞与CD8+T细胞呈负相关[88]。

肿瘤内B细胞最终的影响在许多方面受到TLS内其自身表型、分泌的细胞因子、分化为PCs产生的抗体类型、Treg和激活的巨噬细胞的存在的直接影响[91, 92]。激活的B细胞中PD-1的存在抑制了BCR介导的信号传导，影响了自身成熟和抗体产生。

反过来，抗PD-L1抗体作用于PD-L1+Breg细胞可能会损害它们对CD8+和CD4+T细胞的抑制作用[93]。尽管在肾细胞癌（RCC）中观察到了分泌IgG和IgA的PCs，但只有很少的IgA存在，有效的抗肿瘤活性主要与IgG相关[94]。IgA的产生可能与免疫抑制性的TGF-β以及抑制性细胞因子PD-L1和IL-10有关[52, 95]。这表明它们通常与不良预后相关（图2b）[96]。

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在LUAD中，高比例的肿瘤内IgA与不良预后相关[65]

Breg亚群，一种B细胞类型，可以诱导Treg细胞的分化，并与癌症的不良临床结果相关[97]。Breg细胞产生的细胞因子，如IL-10、IL-35和TGF-β，一方面可能间接抑制抗肿瘤免疫反应，另一方面也可能损害T细胞的效应功能，使巨噬细胞向免疫抑制表型倾斜[1]。这最终导致抗肿瘤免疫反应效率低下。在BC中，观察到Breg细胞存在于含有Treg细胞的E-TLS样淋巴聚集体中，它们的共存导致较短的转移无生存期，与仅Treg细胞相比[98]。

与不良预后相关的肿瘤相关髓系细胞已被报道。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表达PD-L1，可以直接或间接抑制T细胞反应，通过招募Tregs[99]。此外，巨噬细胞产生的吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）对免疫细胞具有抑制作用[100]。M2极化的巨噬细胞与BC、脂肪肉瘤和胃肠间质瘤中的不良癌症预后相关[101-103]。

在结直肠癌肝转移患者的TLS分析中，发现肿瘤内Treg细胞、M2巨噬细胞和Tfh细胞的密度显著高于肿瘤周围TLS，且与不良生存相关[104]。在淋巴管畸形（LM）的啮齿动物模型中，M2极化的巨噬细胞可能通过TLS在感染的LM中积累，并通过分泌VEGF促进疾病进展[105]。

综上所述，TLS中的Tfr细胞、Breg细胞、Treg细胞和M2巨噬细胞等免疫细胞在肿瘤免疫中发挥着关键作用。它们通过分泌抑制性细胞因子、促进免疫抑制细胞的分化、抑制抗肿瘤免疫反应等方式，与B细胞和T细胞相互作用，共同影响肿瘤的生长和进展。

这些细胞间的相互作用在肿瘤微环境中形成了一个复杂的网络，其平衡状态决定了肿瘤的免疫状态和患者的预后。因此，深入研究这些免疫细胞的功能和相互作用机制，对于开发有效的癌症免疫治疗策略具有重要意义。

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三、TLS作为肿瘤预后的生物标志物

多项研究表明，TLS与增强的客观响应率相关，表明TLS是免疫治疗的潜在标志物。鉴于TLS对肿瘤免疫的贡献，研究人员越来越多地探索TLS的存在性质及其遗传特征，以开发精确可靠的预测肿瘤患者预后和治疗的生物标志物（表2）。

表2提供了关于不同TLS特征对不同疾病类型预后影响的详细数据。

以下是对表中内容的分析：

TLS特征：

1. 数量和密度：TLS的高密度与更好的预后相关联。例如，在肝内胆管癌(iCCA)患者中，通过多重免疫组化(mIHC)技术观察到TLS的存在与更好的预后呈正相关。
2. 位置：TLS的位置（肿瘤内或肿瘤周围）也对预后有显著影响。在iCCA和结直肠癌(CRC)肝转移中，肿瘤内的TLS与更好的预后相关，而在肿瘤周围的TLS则没有显示出预后意义。
3. 分子或组织特征：特定的分子表达，如CXCL13在膀胱癌中，通过RNA测序发现与更好的预后相关。此外，流感A病毒在小鼠模型中的研究也显示了TLS的正向预后价值。

疾病类型：

• 肝内胆管癌(iCCA)：TLS的数量和密度、位置（肿瘤内）与更好的预后相关。
• 肝细胞癌(HCC)：TLS的数量和密度、肿瘤内的位置与更好的预后相关，但肿瘤周围的TLS则没有显示出预后意义。
• 结直肠癌(CRC)肝转移：肿瘤内的TLS与更好的预后相关。
• 黑色素瘤：肿瘤周围的TLS与更好的预后相关，但肿瘤内的TLS与预后无关。
• 膀胱癌：CXCL13的表达与更好的预后相关。
• 胰腺神经内分泌肿瘤：TLS的数量和密度与预后无关。

方法论：

• 多重免疫组化(mIHC)：用于检测和定量TLS的组织学特征。
• 免疫组化(IHC)：用于检测特定蛋白的表达，以评估TLS的存在和特征。
• H&E染色：常规的组织染色方法，用于观察组织结构。
• RNA测序(RNA seq)：用于分析基因表达，可以揭示TLS相关的分子特征。
• 流式细胞术：用于细胞表面标记的检测，可以评估TLS中的免疫细胞类型。

预后价值：

• 正相关：表示TLS特征的存在与更好的预后相关联。
• 无预后意义：表示TLS特征的存在与疾病预后无关。
• 负相关：表示TLS特征的存在与较差的预后相关联。

表2强调了TLS作为生物标记物在不同癌症类型中的预后价值，同时也指出了需要进一步研究以确定TLS特征与预后之间关系的确切性质。

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3-1：TLS的数量、密度和位置影响肿瘤预后

在实体肿瘤中，TLS的存在通常与有利的预后相关，因为它们指示有效的免疫浸润。

与II期相比，III期NSCLC患者中TLS的数量显著较低，这表明肿瘤细胞通过失调特定的趋化因子途径，促进TLS的形成，从而逃避免疫反应[113, 114]。此外，患有慢性阻塞性肺病（COPD）的肺癌患者表现出较少的B细胞和TLS，这与较早的死亡率相关[115]。在TNBC的分析中，高密度的PCs与增加的TLS计数和较佳的预后相关，而低密度PCs的TNBC则不然[116]。

进一步的研究表明，小鼠和人类中均存在肿瘤周围的和肿瘤内部的TLS，偶尔扩展到远离肿瘤的正常组织[91]。目前尚不清楚肿瘤内部和周围的TLS之间的空间位置差异是否具有预测和/或预后价值。

现有的证据表明，肿瘤内部的TLS可能具有更好的预后意义，尽管这一结论尚未通过广泛分析得到确认[117]。在BC中，IHC分析显示，与没有周围TLS的患者相比，TLS出现在肿瘤边缘附近或远端的患者预后更差，周围TLS密度的增加进一步恶化了预后[118]。

另一项关于BC的研究发现，TILs几乎在所有转移性部位都被观察到，而TLS仅在肝脏和肺部被发现，其在脑转移性病变中的存在几乎可以忽略不计[119]。

这项研究暗示，TA-TLS的存在和结构与TME和解剖位置相关，并且TLS在不同空间水平的组织是由不同的机制创建的，这需要进一步探索，以了解它们的免疫学性质以及对患者生存和治疗反应的影响。

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3-2：TLS检测和定量分析

目前检测TLS的传统方法包括苏木精和伊红（H&E）染色、免疫荧光（IF）、多重免疫组化（mIHC）和空间转录组学[120]。这些技术依赖于对特定区域的肿瘤样本的检查，因此由于不可手术的条件导致无法获得手术获得的样本，这限制了它们在TLS检测中的有效性。选择特定的循环标记，以及结合开发和应用视觉成像表征技术，可能会提高TLS检测的准确性和特异性。这一领域的研究正在进行中（图3）。

Fig. 3 描述了对第三级淋巴结构（TLS）进行定量分析的不同策略，这些策略可以帮助将TLS作为癌症检测和免疫反应的预测标志。

1. H&E染色：传统的组织病理学染色方法，可以用来在组织切片中识别和量化TLS。

2. 多重免疫组化（mIHC）：一种可以同时检测多种抗原的技术，有助于更详细地分析TLS中的不同细胞类型和结构。

3. 激光捕获显微切割（LCM）：这项技术允许研究人员从组织切片中精确地切取特定区域，如TLS，以进行进一步的分子分析。

4. 空间转录组学：这是一种新兴技术，可以在单细胞分辨率下分析组织切片中的基因表达，有助于理解TLS在肿瘤微环境中的空间组织。

5. 流式细胞术：这是一种用于分析细胞表面标志物和细胞内分子的技术，可以用来量化TLS中的免疫细胞。

6. 纳米材料：纳米技术的应用可以提高成像的灵敏度和特异性，纳米探针可以用于增强某些成像技术，如CT扫描，以更好地检测TLS。

7. 人工智能（AI）：AI算法可以处理和分析来自各种成像技术的数据，提高TLS检测的效率和特异性。

8. 非侵入性成像：结合纳米探针的CT和/或成像技术，可以实现对TLS的非侵入性检测。

9. 成像信息分析：通过AI算法对成像信息进行进一步分析，可以提高TLS检测的准确性，帮助临床医生做出更准确的诊断。

Fig. 3 展示了一个多学科交叉的研究领域，其中结合了传统的病理学技术、先进的生物技术和现代的成像及计算方法。这种综合方法有助于更全面地理解和量化TLS在癌症发展和免疫反应中的作用，为癌症的早期检测、治疗反应监测和预后评估提供了新的工具和策略。随着这些技术的进步，未来的癌症诊断和治疗可能会变得更加个性化和精准。

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目前，TA-TLS的定量评估方法可以分为两大类：基因组和病理学分析。然而，病理学分析容易受到主观解释的影响，可能导致潜在的偏差。

鉴于这些缺点，与基因组方法相比，病理学分析可能不足以在未来有效地和准确地评估TLS[121]。通过差异基因表达分析，在黑色素瘤中最初确定了九个基因（CD79B、CD1D、CCR6、LAT、SKAP1、CETP、EIF1AY、RBP5、PTGDS）的独特表达签名，预测预后和对免疫治疗的反应[57]。同样，在515名LUAD患者的队列中，这九个转录组范围内的基因准确预测了TLS的存在，表明TLS特征是LUAD患者的一个独立的预后因素[122]。

为了量化TLS，研究人员基于这九个基因的平均表达水平计算了一个TLS特征评分。使用X-tile软件确定高和低TLS特征评分的最佳阈值后，他们将与这些评分相关的患者整体生存率进行了关联。具有较高TLS特征评分表达水平的患者被归类为高TLS组，表明肿瘤内TLS的存在更强烈[123]。

不巧合的是，子宫内膜癌（EC）的差异基因表达分析显示，TLS与CD8+T细胞浸润和L1CAM过表达相关，这仅在形态上成熟的含有GC的TLS中存在[124]。如前所述，成纤维细胞是形成TLS的关键因素。IFN诱导肺成纤维细胞表达包括CXCL13和CXCR5在内的趋化因子，从而促进TLS的形成[109]。与肿瘤TLS相关的CXCL13的表达，可作为膀胱癌中TLS存在的潜在生物标志物，并可能预测患者对晚期疾病的ICI治疗的反应性[108]。

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作为非侵入性成像方法，成像组织学在通过结合学习模型和数字病理学来诊断和治疗肿瘤方面显示出巨大潜力[125]。

据报道，在NSCLC和肝内胆管癌（ICC）患者中，有可能将CT或MRI的成像特征与临床信息相结合，用于肿瘤诊断、疗效评估和预测分子标志物[126, 127]。

新兴的研究表明，将这些成像特征与先进的机器学习模型和数字病理学相结合，可以增强TLS的可视化。最近的一项关于LUAD的研究发现，CT扫描中更坚实的肺结节与高TLS密度相关[128]。利用术前CT成像直方图来预测ICC患者TLS状态和无复发生存率，证明比单独的成像直方图或临床模型更有效地评估肿瘤内TLS状态[129]。

研究人员开发了一种图形全切片成像（WSI）方法来评估淋巴细胞聚集，通过分析CT成像特征，可以区分TLS和其他浸润物[130]。需要注意的是，CT成像主要揭示高密度的淋巴细胞聚集，而不是TLS的独特结构。尽管成像结果与组织病理学发现的TLS位置一致，但它们提供的是相关预测而非明确的见解。

此外，包括在成像扫描中部署纳米探针以识别TLS特异性标记在内的探索性技术，在免疫学成像领域标志着显著的进步。Li等人确定了CT成像特征，使HCC术前非侵入性TLS预测成为可能[131]。在一项使用针状光学相干断层扫描（OCT）评估淋巴结的研究中，研究人员考虑信号快速衰减的区域为GC，并最小化成像探针以查看内部节点的B细胞和GC，理论上允许成像TLS[132]。虽然这些创新技术前景光明，但它们仍处于实验阶段，需要进一步验证才能被认为是完全发展的。

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人工智能（AI）技术的发展引入了进行图形数据深度学习的新颖手段。

这些技术可以与图像特征相结合，以促进识别TLS的新方法。

HookNet，一个用于组织病理学WSI的分割模型，可以通过识别已知的TLS来准确识别含有GC的TLS[133]。这种方法已经应用于肺癌的检测。

此外，TESLA，一个用于在空间转录组学中标记组织像素级的机器学习框架，能够直接注释组织图像中的免疫和肿瘤细胞，并进一步检测在TME中的TLS[134]。

AI与基因组学、空间基因组学和免疫评分未来的整合，将能够开发出强大的TLS定量方法。这些方法具有应用于多种癌症类型的潜力，确保基因水平的定量稳定性。

随着技术的发展，将AI与高通量技术如空间转录组学相结合，可以进一步提高TLS检测和定量分析的准确性和效率。例如，AI可以辅助解读高通量数据，识别TLS相关的分子特征，从而更准确地预测患者的预后和治疗反应。此外，AI还可以帮助开发新的成像技术，如利用深度学习算法分析CT或MRI图像，以非侵入性的方式预测和评估TLS的存在和功能状态。

总的来说，TLS的检测和定量分析是癌症免疫学研究中的一个重要方面，对于理解肿瘤微环境中的免疫反应和开发新的治疗策略具有重要意义。随着技术的进步和研究的深入，我们可以期待未来会有更多创新的方法和技术出现，以提高TLS检测和定量分析的准确性和效率。

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四、临床前诱导TLS及其应用前景

TLS和B细胞在多种肿瘤类型中的存在，包括鳞状细胞癌、黑色素瘤、软组织肉瘤和肾细胞癌，预测了对免疫检查点阻断（ICB）治疗的积极反应，表明ICB在治疗富含B细胞和TLS的肿瘤中可能发挥更大的作用[11, 17, 57, 135, 136]。

此外，在黑色素瘤和LUAD中，浆细胞样B细胞特征和TLS相关B细胞特征被发现与ICB反应呈正相关[107, 137–139]。为了提高ICB治疗后的临床结果，需要进一步研究支持TLS诱导和激活B细胞的疗法。

在癌症小鼠模型和癌症患者中，细胞因子和趋化因子、化疗、放疗、癌症疫苗和ICB治疗已显示出诱导肿瘤内TLS形成和增加免疫细胞浸润的能力（表3）。

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表3列出了用于诱导三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures, TLS）的不同治疗方法，以及它们在不同类型的癌症实验对象中的效果。

以下是对表中内容的分析：

治疗方法：

1. 使用细胞因子或趋化因子：例如CXCL13和CCL21被用于胰腺导管腺癌（PDAC）的治疗，通过免疫荧光（IF）、H&E染色、IHC等方法观察到TLS的增加。
2. LIGHT-VTP：通过血管靶向肽（VTP）将LIGHT定位到肿瘤血管，用于胰岛瘤的治疗，通过H&E染色、IHC、IF和流式细胞术观察到TLS的增加。
3. STING激动剂：用于黑色素瘤的治疗，通过IF和流式细胞术观察到TLS的增加。
4. CD40激动剂：用于胶质瘤的治疗，通过H&E染色、IHC、IF、RNA测序等方法观察到TLS的增加。
5. 放射疗法：用于非小细胞肺癌（LUAD）的治疗，通过H&E染色和IHC观察到TLS的增加。
6. 新辅助化疗：用于肝母细胞瘤和上皮样间皮瘤的治疗，通过H&E染色、IHC、RNA测序等方法观察到TLS的增加。
7. 维持性免疫疗法：用于黑色素瘤和肾细胞癌（RCC）的治疗，通过H&E染色、IHC、IF、RNA测序、流式细胞术观察到TLS不变（UC）。
8. HPV 16疫苗：用于宫颈癌的治疗，通过H&E染色、IHC、RNA测序观察到TLS的增加。
9. 胰腺肿瘤疫苗：用于胰腺癌的治疗，通过H&E染色、IHC、RNA测序、流式细胞术观察到TLS的增加。

癌症类型：

• 表中涵盖了多种癌症类型，包括胰腺导管腺癌、胰岛瘤、黑色素瘤、胶质瘤、非小细胞肺癌、肝母细胞瘤、上皮样间皮瘤、黑色素瘤、肾细胞癌和宫颈癌。

实验对象：

• 实验对象包括小鼠模型和人类患者，这表明了TLS诱导策略在临床前研究和潜在的临床应用中的广泛性。

TLS变化：

• 大多数治疗方法都观察到了TLS的增加，这表明这些策略可能有助于促进肿瘤微环境中的免疫反应。
• 在某些情况下，如黑色素瘤和肾细胞癌的维持性免疫疗法，TLS没有变化，这可能表明需要进一步研究以优化治疗方案。

表3展示了多种用于诱导TLS的方法，这些方法在不同的癌症类型中显示出了促进免疫反应的潜力。这些发现对于开发新的癌症免疫治疗策略具有重要意义，并可能有助于提高现有治疗的效果。然而，需要更多的研究来确定这些方法在临床上的安全性和有效性。

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在胰腺癌中，靶向LIGHT通过血管靶向肽（VTP）定位到肿瘤血管，通过胰腺癌的自放大循环诱导血管正常化和HEV及TLS的形成。

机制可能是LIGHT刺激巨噬细胞表达炎症细胞因子CXCL13、CXCL21、TNF和IL-6，从而招募T细胞并促进TLS的形成[140, 141]。低剂量的STING激动剂增强T细胞和DC浸润，促进炎症性TME，刺激DC成熟，导致局部分泌CCL19、CCL21、LTα、LTβ和LIGHT，从而促进血管正常化和TLS的形成[142]。

在一项39例切除PDAC患者接受GM-CSF疫苗治疗的试验中，33例在疫苗接种后两周内出现了TLS聚集。抑制Treg信号通路并在这些TLS聚集中增强Th17信号与增加生存率相关[143]。通过IHC分析TLS在胰腺癌患者中的预手术新辅助化疗（NAC）发现，TME组成改变、免疫细胞比例增加和有利的预后[144]。

然而，一项关于肺癌鳞状细胞癌（LSCC）患者的研究发现，化疗期间使用皮质类固醇影响GC和TLS的形成[47]。重要的是，支持某些免疫疗法能够启动癌症中TLS的明确证据目前尚不足，需要进一步的经验研究。

具体来说，尽管放疗已被观察到触发肿瘤内TLS的形成，但这种现象主要是由低剂量辐射引起的局部免疫细胞的立即耗竭，伴随着现有TLS大小的减少，通常在两周内恢复[145, 146]。因此，目前尚无充分证据支持放疗诱导TLS。

重要的是，传统癌症免疫疗法存在局限性，例如系统毒性不一和治疗结果异质性，这取决于所采用的免疫疗法的类型[7, 147]。最近纳米技术和生物材料的发展揭示了癌症免疫疗法创新的重要潜力[148]。

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4-1：胶原基质

哺乳动物结缔组织中胶原的形成需要复杂的细胞内和细胞外过程。其生物活性源于其复杂的结构，这促进了它在最近生物合成应用中的使用[157]。

在小鼠中，最初通过植入来自表达LTα的胸腺间质细胞系的合成胶原基质来创造TLS，从而产生功能性TLS[158]。随后，将这些结构植入严重联合免疫缺陷小鼠中，导致强烈的二次免疫反应和高水平的亲和力IgG抗体产生[159]。同样，含有化学因子CCL19、CCL21、CXCL12、CXCL13和可溶性RANKL以及LTα1β2的胶原海绵支架被植入小鼠肾脏，成功地构建了包含隔离的B和T细胞区域以及HEVs的TLS[160]。

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4-2：水凝胶

水凝胶是一种独特的实体，由三维交联的聚合物网状结构组成，由于其生物相容性、水分保留和生物粘附特性等有利生物特性，可以延长药物的有效期，使其成为一种出色的治疗载体[161]。

根据Alberto Purwada等人的研究，含有表达BAFF和IL-4的间质细胞的水凝胶增强了生发中心（GC）的反应，促进了抗体类别转换事件[162]。

最近，研究人员构建了一种干扰素基因激活水凝胶，它启动并激活了干扰素基因刺激因子（STING）和TLR-9通路，以增强TLS的形成[163]。

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4-3：纳米材料

作为运输载体，纳米材料可以以受控的方式将生物活性组合负载输送到体内的特定部位，并通过其高特异性，从而有效地减少剂量和脱靶毒性[164]。

纳米医学与免疫疗法的结合已在增强抗肿瘤免疫反应和改善治疗反应的安全性方面取得成效[165]。在一项模拟小鼠鼻咽癌模型的研究中，研究人员开发了一种纳米疫苗，该疫苗由Epstein-Barr病毒（EBV）核抗原1（EBNA1）和鞣酸组成，与Mn2+和CpG作为双重佐剂结合。这种制剂通过TLR-9和STING信号通路协同激活DCs、B细胞和T细胞。此外，它通过激活LT-α和LT-β途径增强TME中CCL19/CCL21、CXCL10和CXCL13的分泌，共同促进外周免疫细胞的招募，从而促进TLS的形成，增强局部免疫反应并延迟肿瘤生长[166]。

“Nano-sapper”是一种生物材料，包含一个抗纤维化的磷酸化α-芒果宁核心和一个编码免疫增强细胞因子LIGHT的质粒。这种生物材料已被证明可以促进TLS的形成并阻碍肿瘤生长。这种生物材料通过逆转成纤维细胞的异常激活、减少胶原沉积、在肿瘤内正常化血管，并增强淋巴细胞产生的趋化因子的局部表达来实现其效果。这些作用导致CTLs的渗透增加、肿瘤内TLS的诱导、TME的重塑，并提高了ICB疗法的疗效[167]。

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4-4：3D技术和器官模型

三维（3D）支架，通过3D打印技术制造，为癌症疫苗提供了比水凝胶支架更优越的输送机制，这归因于它们卓越的多孔结构和生物安全性。研究表明，这些3D支架，当负载免疫调节剂时，可以招募和激活大量免疫细胞，特别是APCs和T细胞，模仿淋巴器官的功能。这一过程促进了“人工三级淋巴结构”的发展，已被证明能有效抑制肿瘤生长[168]。

人类器官模型在器官发育和疾病发生、临床前药物开发以及再生医学等方面具有巨大的潜力[169]。器官模型本质上是在体外通过3D细胞培养技术形成的多细胞簇，为我们提供了可能与TLS诱导相关的模型[170]。Küçükköse E和同事利用患者衍生的器官模型开发了一个人化小鼠模型，用于自发多器官肿瘤转移。

研究发现，ICB治疗成功消除了肝脏转移瘤，而没有影响腹膜转移瘤，与缩小原发肿瘤相反，治疗停止后原发肿瘤和肝脏转移瘤的大小增加了，在原发肿瘤和肝脏转移瘤部位观察到B细胞浸润和TLS形成，但在腹膜转移瘤部位没有观察到，这可能解释了ICB治疗结果的差异[171]。

然而，由于其低成功率、血管形成困难、重复性和变异大以及成本控制困难，器官模型构建的临床应用受到限制[172]。最近的研究将器官模型与3D生物打印和器官疫苗相结合，为癌症建模的精准研究开辟了新的可能性，并解决了一些在器官研究中遇到的困境和限制。3D生物打印和器官微阵列可以生成或模拟血管系统，为器官模型提供营养，从而促进其生长和发育[172, 173]。Goyal等人还发现，从人体外周血非侵入性分离的T和B淋巴细胞可以在双通道器官芯片微流体控制系统中自发组装成外生淋巴结[174]。这些为TLS诱导策略提供了新的思路。

通过阐述传统的癌症免疫疗法以及基于纳米技术和生物材料开发的方法来诱导TLS，可以得出结论，TLS诱导机制可能通过多种细胞、多种趋化因子和多种信号通路共同作用形成的网络机制。尽管不同诱导策略产生的中间效应不尽相同，但它们似乎都减弱了TME的免疫抑制效应，同时增强了免疫细胞的功能，从而激活了TLS产生的信号级联途径。

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五、结论与展望

TLS的空间结构（生发中心的存在）、细胞组成（高密度的TIL浸润和免疫细胞表型的差异）以及与肿瘤位置的关系（肿瘤周围或肿瘤内部）都会影响肿瘤患者的预后[3, 4, 25, 48, 175]。

值得注意的是，TLS在肿瘤免疫中的双重作用——所谓的“双刃剑”效应——可能更多地取决于TLS内各种免疫细胞亚群的比例，特别是考虑到观察到的T和/或B细胞表型的变异性。

在T细胞亚群中，CD4+T滤泡辅助（Tfh）细胞，表达高水平的CXCR5和Bcl6，以及CD8+T细胞，是T细胞亚群中对肿瘤免疫的主要贡献者。然而，TLS修饰的CD8+T细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用的机制尚不明确。Tfh细胞通过高表达共刺激受体（ICOS和CD153）促进B细胞的招募，从而减缓肿瘤进展。

Tfr细胞，表现为CD25CXCR5GARPFOXP3，通过TGF-β抑制Tfh细胞的活动。尽管Breg细胞的标记尚未达成共识，但它们分泌的免疫抑制性细胞因子，如IL-10、IL-35和TGF-β，可以抑制效应T细胞的活动并促进Treg细胞的扩张，从而促进肿瘤生长。

通过RNA测序（RNA-seq）或特定抗体对B细胞亚群进行表征，发现除了Breg细胞外，所有B细胞亚群通常与积极的临床结果相关。TLS内GC-B细胞的就地激活对于分化及抗体产生进一步凸显了B细胞在癌症免疫周期中的重要性。不同免疫细胞亚群的表型主要取决于TME中具有不同免疫特性的细胞因子，以及细胞信号通路的未知影响。

作为影响和确定癌症患者预后的新颖特异性生物标志物，TLS的未来发展涉及两个主要方面。尽管TLS的生物标志物已得到广泛研究，但在不同患者和不同癌症中TLS的量化标准尚未建立。首先，我们需要关注TLS异质性对不同癌症类型量化评估的困难。特定TLS标记、成像技术和AI在病理学中的联合应用可能为TLS检测和定量分析开辟新的途径。

其次，我们需要有效地诱导肿瘤内TLS的发生和成熟。传统的诱导方法，如通过注射细胞因子或趋化因子、放疗、化疗、ICB治疗和癌症疫苗，在动物模型或人类中已成功诱导TLS，但新型生物材料，如胶原机制、水凝胶、纳米材料以及器官模型和3D技术的开发，已经复兴了TLS诱导并增强了诱导效率。

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Fig. 4 描述了在小鼠和癌症患者中诱导第三级淋巴结构（TLS）的不同方法和未来展望。

1. 细胞因子和趋化因子：

   • 使用细胞因子（如IL-7、IL-17和RANKL）和趋化因子（如CCL19、CCL21、CXCL12和CXCL13）可以直接或间接促进TLS的形成。

2. 化疗：

   • 某些化疗药物可能通过减少肿瘤负担和改变肿瘤微环境来促进TLS的形成。

3. 放疗：

   • 放疗可能通过诱导肿瘤细胞死亡和释放抗原，激活免疫系统，从而有助于TLS的形成。

4. 癌症疫苗：

   • 癌症疫苗通过提供肿瘤特异性抗原，激活免疫系统，可能促进TLS的形成和增强抗肿瘤免疫反应。

5. 免疫疗法：

   • 免疫检查点抑制剂和其他免疫调节疗法可以解除肿瘤诱导的免疫抑制，促进TLS的形成和功能。

6. 溶瘤病毒（OV）：

   • 溶瘤病毒可以选择性地感染和杀死肿瘤细胞，同时释放肿瘤抗原，激活免疫系统，为TLS的形成创造条件。

7. 生物材料：

   • 生物材料如胶原蛋白基质、水凝胶、纳米材料、三维（3D）支架和类器官提供了一种新的方法来支持TLS的形成和维持。

8. 胶原蛋白基质和水凝胶：

   • 这些材料可以模拟细胞外基质，为免疫细胞提供支持和空间来形成TLS。

9. 纳米材料：

   • 纳米材料可以用于药物递送、作为免疫刺激剂或用于构建支持TLS形成的支架。

10. 三维（3D）支架：

    • 3D支架可以提供物理支持和化学线索，促进细胞间的相互作用和TLS的形成。

11. 类器官：

    • 类器官是自组织的三维细胞结构，可以在体外模拟器官功能，可能用于研究TLS的形成和功能。

Fig. 4 展示了一个多样化的方法集合，这些方法可以单独或组合使用，以促进TLS的形成。这些方法的发展和应用为癌症治疗提供了新的策略，旨在增强患者的抗肿瘤免疫反应。通过在小鼠模型和癌症患者中诱导TLS，研究人员可以更好地理解这些结构在抗肿瘤免疫中的作用，并开发新的免疫治疗手段。此外，这些方法的临床应用前景广阔，可能会带来更有效的癌症治疗策略。

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使用复杂技术，包括新型生物材料，来生成可诱导的TLS的可能性正在被研究，并在临床前模型中取得了非常有前景的结果[176]。然而，将这些技术工具转化为临床应用仍需解决组织安全性、成本控制和选择适当的人源化体内模型的问题。这对于指导TLS在免疫治疗和预后中的进一步精确性和效率至关重要。