常驻巨噬细胞诱导的纤维化在胰腺炎性损伤和PDAC中具有不同的作用

介绍一篇2023年8月10日发表在Nature Immunology的文章

标题： Fibrosis induced by resident macrophages has divergent roles in pancreas inflammatory injury and PDAC

影响因子：30.5

DOI：https://doi.org/10.1038/s41590-023-01579-x

组织驻留巨噬细胞（TRMs）在胰腺炎和胰腺癌中的作用以及它们与单核细胞来源的巨噬细胞之间的不同功能。以下是主要发现和结论的总结：
1. TRMs是能够在组织长期存活的细胞，并在表型上与单核细胞来源的巨噬细胞有所不同。TRMs通常在组织内稳态期间发挥重要作用，但在不同的病理情况下，它们的功能和角色尚不清楚。
2. 研究发现，在小鼠的胰腺炎和胰腺癌中，积累的大部分巨噬细胞来自于TRMs的扩增。这表明TRMs在这些疾病的发展中起着重要作用。
3. 胰腺TRMs表现出与细胞外基质重塑相关的表型，这在炎症期间对维持组织稳态非常重要。TRMs的丧失导致严重的胰腺炎恶化和死亡，原因是腺泡细胞的存活和恢复受到损害。
4. 在胰腺炎期间，TRMs通过触发成纤维细胞的积累和激活发挥了保护作用，这对于启动纤维化作为创伤愈合反应是必要的。然而，相同的TRM驱动的纤维化推动了胰腺癌的发病和进展。
综合这些发现，研究表明TRMs通过调节基质生成在胰腺炎和癌症的病理过程中发挥不同的作用。在胰腺炎中，它们起到保护作用，促使成纤维细胞的激活以进行组织修复，而在胰腺癌中，TRMs驱动的纤维化则有助于癌症的发展和进展。这些研究结果有助于更深入地理解胰腺炎和癌症的发病机制。

图1

主要在造动物模型和验证一些指标

1 .淀粉酶（amylase，腺泡细胞主要负责合成和分泌胰液中的消化酶，包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。
2. 在胰腺中，CK19通常用作上皮细胞标志物，特别是在胰腺导管上皮细胞中表达较高，在胰腺研究中，CK19的表达通常用于标记和识别导管细胞和胰腺内分泌细胞（如胰岛细胞）之间的区别。CK19阳性的细胞主要位于胰腺导管中，而胰岛细胞通常是CK19阴性的。
3 .SOX9在胰腺中，SOX9的表达与胰岛细胞和导管细胞的发育和维护密切相关。它在导管细胞中的表达是维持导管结构和功能所必需的。
4.podoplanin+ fibroblasts：Podoplanin ( PDPN ) 是一种跨膜受体糖蛋白，在转化细胞、癌症相关成纤维细胞和炎症巨噬细胞上表达上调，从而促进癌症进展。特别是，PDPN增加肿瘤细胞克隆能力、上皮间质转化、迁移、侵袭、转移和炎症。
5.“trichome” 通常指的是染色组织切片中使用某种染色技术（通常是Masson’s Trichrome染色）染色的结构，它可以帮助可视化胶原纤维。在胰腺炎和PDAC组织中，可能存在较多的胶原纤维沉积，这与纤维化过程有关
6. 在细胞样本中检测F4/80抗原的存在，从而确定巨噬细胞的位置和数量
7 .淀粉酶（amylase，腺泡细胞主要负责合成和分泌胰液中的消化酶，包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。
8.ADM是"腺泡到导管细胞转化ADM通常发生在以下情况下：
胰腺炎（Pancreatitis）：急性或慢性胰腺炎是一种胰腺疾病，常伴随着炎症和腺泡细胞损伤。在 炎症期间，一些腺泡细胞可能会经历转化，变成导管细胞，以恢复受损的胰腺导管。
胰腺癌（Pancreatic Cancer，PDAC）：胰腺癌通常源自胰腺导管细胞。在PDAC的发展中，一些病例中可能会出现ADM，其中部分腺泡细胞转化为恶性的导管细胞，从而促进肿瘤的发展。

从图A 中观察到人类胰腺炎和PDAC组织的组织学分析都显示与正常组织相比，腺泡细胞区域明显减少，纤维化间质增加。巨噬细胞、Podoplanin+成纤维细胞以及trichome+胶原区域的数量增加。接着给老鼠打Cerulein导致消化酶的过量产生，从而引发慢性胰腺炎。（这个是慢性胰腺炎造模和急性造模的方法）发现ADM的产生，小鼠中F4/80+MHCII+巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、Ly6G+粒细胞和Ly6C+单核细胞的增加 ，验证造模成功。

图2

旨在探讨胰腺炎中巨噬细胞数量增加的原因，究竟是由于单核细胞的招募还是TRMs（组织驻留巨噬细胞）的局部扩增。

1.创建Flt3-YFP小鼠模型：
研究人员交叉配对Flt3-Cre小鼠和R26-LSL-eYFP小鼠，以生成Flt3-YFP小鼠模型。在这个模型中，成年骨髓源细胞具有YFP标记（骨髓中发育成熟的单核细胞），而胚胎源巨噬细胞则不具备YFP标记（组织驻留巨噬细胞）。 Flt3-Cre小鼠：Flt3-Cre小鼠是一种转基因小鼠，其基因组中含有Flt3（FMS-like tyrosine kinase 3）基因的启动子区域与Cre重组酶基因相连。Cre重组酶是一种酶，能够识别特定DNA序列，并使其发生重组。
R26-LSL-eYFP小鼠：R26-LSL-eYFP小鼠也是一种转基因小鼠，其基因组中含有LSL-eYFP序列。“LSL” 代表 “LoxP-Stop-LoxP”，这是一种基因开关系统，其中包含了LoxP重组位点，与Cre重组酶相互作用。当LoxP位点之间存在一个“停止”序列（如“Stop codon”）时，目标基因的表达会被阻止。
这个模型发现当胰腺炎产生时组织驻留巨噬细胞募集巨噬细胞 13倍，而单核分化是5倍。
2.又构建一个转基因CSF1R-mer-iCre-mer;LSL-tdTomato小鼠模型，可以特异性地标记了在胚胎红细胞-髓系前体细胞的荧光蛋白tdTomato。图e结果显示，脑部微胶质细胞（来源于卵黄囊）的重新组合率接近80％，而Ly6Chi单核细胞的tdTomato标记很少。胰腺炎中的约有10％是tdTomato阳性，表明胰腺TRMs的一个亚群来源于胚胎前体细胞。
3.一些胚胎来源的巨噬细胞会在不同程度上被单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）所替代。这种替代过程在不同组织中是具体的，并可能对组织的功能和免疫反应产生影响。先给正常成年CSF1R-tdTom小鼠中，通过口服给予tamoxifen治疗5天，然后停止喂tamoxifen，持续10周达到将髓系发育巨噬细胞清除的效果，通过图J-K发现TRMs中有tamoxifen阳性，巨噬细胞数目没有阴性的多，考虑到髓系发育巨噬细胞清除，只有成人造血干细胞分化。所以这个TRMs在胰腺炎中分化来源是由人造血干细胞分化占比多，而器官中的TRMs占比相对较少。

图3

研究了胰腺损伤和癌症期间巨噬细胞的表型和基因表达的变化，以及这些变化与巨噬细胞的发育来源之间的关系。

1.Lyve1hi 和 Lyve1lo macrophages：Lyve1hi表示LYVE1高表达的巨噬细胞，而Lyve1lo表示LYVE1低表达的巨噬细胞。LYVE1是一种分子标记，用于标识巨噬细胞的亚群。
2.ECM remodeling（细胞外基质重塑）：指的是细胞外基质（ECM）中蛋白质成分的改变和修复，通常与组织修复和纤维化过程相关。
3.antigen processing and presentation（抗原处理和呈递）：是免疫系统中的过程，巨噬细胞通过处理外源抗原并呈递给T细胞，从而激活免疫反应。
4.TGF-β signaling：是一种细胞信号通路，参与细胞生长、分化和免疫调节等生物学过程。

通过使用RNA测序和单细胞RNA测序技术，分析了胰腺中不同来源的巨噬细胞在胰腺损伤和癌症中的表达差异和功能。研究结果表明，巨噬细胞的发生学起源和细胞外基质重塑在这些过程中发挥重要作用，巨噬细胞的表型可能受到不同组织环境的影响。其中，LYVE1高表达的巨噬细胞在胰腺中具有独特的表达特征和分布，可能与胰腺损伤期间的纤维化有关。

图4

研究发现，在人类胰腺组织中，存在与小鼠中的Lyve1巨噬细胞类似的巨噬细胞亚群，这些巨噬细胞在表达基因和功能上显示出相似的特征。这些巨噬细胞亚群的特征包括对细胞外基质（ECM）重塑、TGF-β信号通路和VEGF途径的富集。研究还发现，这些类似的巨噬细胞在胰腺炎和胰腺癌组织中的分布和定位与小鼠中的Lyve1巨噬细胞相似。

图5
这段文本描述了在胰腺炎（pancreatitis）病理状态下，研究了组织驻留巨噬细胞（TRMs）和单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）在维护组织完整性方面的不同功能影响。
CSF1Ab-CLD是一种治疗试验中使用的方法，旨在耗尽组织驻留巨噬细胞（TRMs）。这个方法包括使用CSF1（巨噬细胞集落刺激因子1）中和抗体来中和CSF1，以及使用clodronate负载的脂质体来耗尽巨噬细胞。CSF1是一种细胞因子，它对巨噬细胞的生存和增殖起着重要作用。通过中和CSF1和使用clodronate脂质体，可以暂时削弱或减少巨噬细胞的数量，从而允许研究人员研究巨噬细胞在不同生理和病理条件下的作用。

这段文本描述了一个实验，研究人员通过使用CSF1抗体和CLDs（clodronate-loaded liposomes）来减少小鼠胰腺中的组织驻留巨噬细胞（TRMs），并研究了它们对胰腺炎的影响。以下是文本中提到的主要结果和实验步骤：

1. 实验使用了两组小鼠，一组接受了CSF1抗体和CLDs（CSF1Ab+CLD）处理，另一组接受了IgG和PBS负载的脂质体（IgG+PBS）处理。

2. 通过流式细胞术对血液中的Ly6Chi单核细胞和胰腺中的F4/80+MHCIIhi/lo巨噬细胞进行分析。结果显示，在恢复期（day -1）后，CSF1Ab+CLD处理的小鼠血液中的Ly6Clo和Ly6Chi单核细胞的数量显著减少。

3. 使用多标记免疫组织化学染色（mIHC）对胰腺组织进行了分析，包括F4/80、LYVE1、CD163和CK19的染色。结果显示，CSF1Ab+CLD处理的小鼠胰腺中，F4/80+LYVE1+CD163+巨噬细胞的数量显著减少。

4. 测量了小鼠在实验期间的体重变化。结果显示，CSF1Ab+CLD处理的小鼠在接受Cerulein诱导的胰腺炎后，体重持续下降，并在较早的时间点达到终点。

5. 使用Kaplan-Meier生存曲线显示，CSF1Ab+CLD处理的小鼠在接受Cerulein诱导的胰腺炎后，存活率显著降低。

6. 对胰腺组织进行了组织学分析，包括CK19、amylase和cleaved caspase-3（CC3）的染色。结果显示，CSF1Ab+CLD处理的小鼠胰腺中，CK19阳性细胞、amylase阳性细胞和CC3阳性细胞的数量在人道终点时显著增加。

7. 对胰腺组织进行了进一步的分析，包括在实验后第6天进行CK19、amylase和CC3的染色。结果显示，CSF1Ab+CLD处理的小鼠胰腺中，在实验后第6天，CK19阳性细胞、amylase阳性细胞和CC3阳性细胞的数量均显著增加。

总之，这些结果表明，CSF1Ab+CLD处理导致了胰腺中TRMs的减少，进而影响了胰腺炎的发病和病程，包括体重下降、存活率降低以及胰腺组织的病理变化。这有助于深入理解TRMs在胰腺炎中的作用。

图6
旨在研究组织驻留巨噬细胞（TRMs）在胰腺炎期间对纤维化反应的影响。
结果表明，TRMs可能通过促进胰腺中的间质形成影响胰腺炎的恢复，而不会影响腺泡细胞的ADM。此外，TRMs还参与了胰腺损伤期间的纤维母细胞的激活和扩张。

a. 图片和CK19免疫组织化学（IHC）染色的定量分析显示，CSF1Ab+CLD处理的小鼠在恢复期后接受Cerulein诱导的胰腺炎治疗后，胰腺组织中CK19+细胞的百分比明显增加，与IgG+PBS处理组相比，这一差异具有统计学意义（*P = 0.0012）。

b. 显示了通过多标记免疫组织化学（mIHC）染色的胰腺组织的代表性图像，用于分析不同标记物（hematoxylin、amylase、CK19、Sox9、Ki67和podoplanin）。图像中显示了这些标记物的定位和表达情况。

c. 通过分析CK19、Sox9、Ki67和podoplanin的表达， quantification表明CSF1Ab+CLD处理组和IgG+PBS处理组之间在淀粉酶阳性腺泡细胞中表达这些标记物的百分比没有显著差异（除了podoplanin的分析，*P = 0.0022）。

d. 图片和分析显示，CSF1Ab+CLD处理组的胰腺组织中podoplanin+区域的百分比明显降低，与IgG+PBS处理组相比具有统计学意义（*P = 0.0012）。

e. 通过流式细胞仪分析显示，CSF1Ab+CLD处理组与IgG+PBS处理组在胰腺纤维母细胞的分布模式上存在差异。

f. 通过图形表示，显示了CSF1Ab+CLD处理组和IgG+PBS处理组在胰腺纤维母细胞、Ly6C+炎性纤维母细胞和PDGFRa+纤维母细胞方面的数量差异。这些差异在统计学上具有显著性。

g. 显示了对Lyve1-Cre-小鼠（对照组）和Lyve1-CreCSF1Rflox/flox小鼠（Lyve1ΔCSF1R）的胰腺组织进行的mIHC染色的代表性图像，以及胰腺中F4/80+LYVE1+CD163+巨噬细胞的百分比分析。结果显示，Lyve1ΔCSF1R小鼠中这些巨噬细胞的数量显著减少，与对照组相比具有统计学意义（*P <0.0001）。

h. 显示了对对照组和Lyve1ΔCSF1R小鼠的胰腺组织进行的podoplanin染色的代表性图像，以及podoplanin+区域的百分比分析。结果显示，Lyve1ΔCSF1R小鼠中podoplanin+区域百分比明显减少。

i. 通过流式细胞仪分析显示，对照组和Lyve1ΔCSF1R小鼠的胰腺中podoplanin+纤维母细胞的分布模式。

j. 图表表示对照组和Lyve1ΔCSF1R小鼠的胰腺中podoplanin+纤维细胞和PDGFRa+纤维细胞的数量差异。这些差异在统计学上具有显著性。

这些结果表明，CSF1Ab+CLD处理可能影响胰腺中TRMs和纤维细胞的分布和功能，这可能对胰腺炎的病理过程产生影响。这些结果有助于更深入地理解TRMs在胰腺疾病中的作用。

图7
这部分内容主要关注了纤维母细胞的表型，并通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析来探讨组织驻留巨噬细胞（TRMs）对纤维母细胞的影响。

a. 图中展示了从经过10天休息后接受了1周每隔一天六次腹腔注射Cerulein的IgG + PBS或CSF1Ab + CLD小鼠中分选的胰腺podoplanin+纤维母细胞的UMAP图。

b. UMAP图显示了在IgG + PBS和CSF1Ab + CLD小鼠的podoplanin+胰腺纤维母细胞中Pdpn、Pdgfra、Ly6c1、Acta2和Col8a1的表达。

c. UMAP图展示了在IgG + PBS和CSF1Ab + CLD小鼠的podoplanin+胰腺纤维母细胞中将纤维母细胞聚类分为Ly6C+ iFib、αSMA+ myFib和MHCII+ apFib亚型。

d. UMAP图展示了来自IgG + PBS或CSF1Ab + CLD小鼠的podoplanin+胰腺纤维母细胞的UMAP图。

e. 热图显示了在纤维母细胞亚群（如c中所示）之间，与基因集的正标准化富集得分（NES）相关的基因集，比较了IgG + PBS和CSF1Ab + CLD样本。

f. Dot图显示了在IgG + PBS小鼠或CSF1Ab + CLD-treated小鼠的podoplanin+纤维母细胞中上调的差异表达基因（DEGs）。

g. UMAP图展示了Flt3-YFP小鼠的巨噬细胞聚类和IgG + PBS或CSF1Ab + CLD小鼠的podoplanin+纤维母细胞之间的PDGF、CCL、CSF1、VCAM和GAS信号通路网络的CellChat分析的网络中心性度量的发送器（配体信号）和接收器（受体）的相对重要性。

h. 小提琴图显示了PDGF信号通路基因Pdgfa、Pdgfb、Pdgfc、Pdgfra和Pdgfrb在巨噬细胞和纤维母细胞聚类中的表达。

i. 图中显示了接受每天一次PDGFRi或Veh以及每隔一天六次Cer腹腔注射1周的小鼠的胰腺组织，用podoplanin或fibronectin染色。比较了Veh和PDGFRi处理后的胰腺组织中的podoplanin+和fibronectin+面积。

j. 图中量化了与i中处理的小鼠的胰腺组织中的podoplanin+和fibronectin+面积。

k. 图中显示了接受PDGFRi或Veh以及Cer处理后的小鼠的podoplanin+纤维母细胞的流式细胞术和PDGFRa+纤维母细胞的密度。

l. 这里展示了接受PDGFRi或Veh以及每天10微克Cer通过腹腔渗透泵输送的小鼠的体重测量和Kaplan-Meier生存曲线。

这些结果表明，在TRMs的存在下，纤维母细胞上调了与胶原和ECM相关的基因，而在没有TRMs的情况下，它们的数量减少，表达了与炎性表型相关的基因，而不是与保护性纤维化相关的基因。此外，PDGF信号通路似乎在这一过程中发挥了重要作用，因为PDGFRi处理能够减少纤维母细胞的数量并改善小鼠的生存率。

图八
这部分内容主要讨论了组织驻留巨噬细胞（TRMs）在胰腺导管腺癌（PDAC）的纤维化和进展中的作用，以及在几个遗传模型中对其进行了实验验证。总的来说，这些数据表明，总的TRMs在肿瘤发展过程中促进了纤维间质的扩张。

a、这部分内容包括了对胰腺组织的免疫组织化学染色图像，这些图像显示了用于标记不同细胞类型的抗体的染色结果。图中的F4/80、LYVE1和CD163是用来标记巨噬细胞亚群的抗体。通过定量分析，研究者确定了F4/80+LYVE1+CD163+巨噬细胞和F4/80+巨噬细胞的百分比，以比较IgG+PBS和CSF1Ab+CLD处理的小鼠。结果表明，CSF1Ab+CLD处理的小鼠中F4/80+LYVE1+CD163+巨噬细胞数量显著减少，而F4/80+巨噬细胞数量也有所减少。

b、该部分包括了胰腺组织的H&E和CK19染色图像，用于显示不同处理组之间的组织学差异。图中的左列是H&E染色图像，显示了整个胰腺的结构。中列和右列是CK19染色图像，用于标记胰腺中的肿瘤细胞。通过这些染色图像，可以看出CSF1Ab+CLD处理的KPC小鼠中，肿瘤区域呈囊状外观，且肿瘤分化较好，而IgG+PBS处理的小鼠中，肿瘤区域呈高度侵袭性，组织结构较差。

c、这部分内容包括了对不同组织区域的定量分析结果，包括囊状区域、低分化/高级别侵袭性胰腺肿瘤病灶、肿瘤病灶和间质区域的百分比，以及CK19+细胞占总细胞数的百分比。结果显示，CSF1Ab+CLD处理的KPC小鼠中，囊状区域的百分比明显增加，而高级别侵袭性区域的百分比减少，肿瘤和间质区域也有所减少，同时CK19+细胞的百分比也下降。

d、这部分包括了对胰腺组织的CK19、podoplanin和αSMA染色图像，用于显示不同处理组之间不同细胞类型的分布情况。CK19染色用于标记肿瘤细胞，而podoplanin和αSMA用于标记纤维母细胞。图像显示CSF1Ab+CLD处理的KPC小鼠中，纤维母细胞的数量较少。

e、这部分包括了不同处理组KPPC小鼠胰腺组织的图像，用于显示CSF1Ab+CLD和IgG+PBS处理对肿瘤区域的影响。

f、定量分析显示CSF1Ab+CLD处理的KPPC小鼠中，podoplanin和fibronectin的表达面积明显减少。

这些结果表明，CSF1Ab+CLD处理可以减少肿瘤区域的纤维化和肿瘤分化，从而影响PDAC的发展。