PhenoCycler-Fusion空间单细胞蛋白组学（简称PCF,原CODEX）技术常见FAQ

1、PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）的片子尺寸是多少？

PCF空间单细胞蛋白组的片子尺寸：

关闭门：（长 x 宽 x 高）71.12*55.88*36.83cm； 

门打开：（长 x 宽 x 高）71.12*55.88*66.04cm。

2、PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）系统运行的时长是多久？

运行的时长从循环开始到QPTIFF的生成结束，具体的运行时间取决于组织大小，曝光时间等。第一个循环较长，但平均而言在1个小时左右。

3、PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）系统目前支持的最大周期循环数是多少？

PCF空间单细胞蛋白组系统目前最多支持35个循环。

4、PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）系统的最大可成像区域有多大？

目前PCF空间单细胞蛋白组系统的成像区域为18mm*35mm。

5、抗体染色步骤是否在仪器上完成？

不，抗体染色部分是手动完成的，可对整个面板一次染色，用户可以同时处理多张玻片。

6、我可以在PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）系统上同时运行多个样品吗？

单次运行检测一张载玻片，但是用户可以在同一张载玻片上放置多个组织或使用组织芯片。

7、为什么有些PhenoCycler Barcode用于多种PhenoCycler抗体？

目前，我们针对不同组织类型（人FF、 FFPE和小鼠FF）抗体建立了商业化的清单，目前具有与不同Barcode偶联的抗体，在一个组合panel中使用抗体时可实现更高的多重分析。除了少数例外，共享Barcode的集合中的抗体不能在同一次运行中使用。我们正在努力验证更多Barcode增加偶联的灵活性。如果客户感兴趣的两种抗体共用一个Barcode，建议用户可自行偶联使得一个抗体上具有特异的Barcode。

8、用于PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）系统上的组织切片可以有多厚？

我们建议切片厚度在4~10μm之间，不要超过10μm，因为这会影响显微镜的自动对焦能力；同时避免组织褶皱和撕裂，因为这会影响后续的数据分析。此外，对于厚度超过10μm的切片，抗体和试剂的渗透也会带来问题。

9、新鲜冷冻组织会随着时间的推移而降解吗？

新鲜冷冻组织需要储存在-80℃，PCF空间单细胞蛋白组工作流程中的固定染色程序需要在将组织切片取出冰箱后立即完成。而染色方案包括抗体与组织的孵育，因此抗体标记非常稳定，并且还可以进行多个循环。抗体染色在4℃条件下下可稳定保存2周。

10、组织脱钙是否与PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）工作流程兼容？

已有实例证明了脱钙组织样本与PCF空间单细胞蛋白组工作流程的兼容性。

11、在使用PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）实验抗体染色期间，溶液中的大量抗体是否会影响抗体-抗原识别？

不会，抗体-抗原特异性识别不受PCF空间单细胞蛋白组实验的高多重水平的影响，主要有两个因素：（1）染色液中抗体的总浓度很低，即使是50个抗体的panel 也大约在~1μM；（2）空间位阻是一种局部现象，涉及到nm级别的分子间相互作用，抗体和抗原之间的低范围接触只会导致弱的、极其短暂的相互作用。也就是说，导致空间位阻现象的局部浓度会明显高于溶液的浓度。当使用一组40+抗体时，细胞表面潜在抗原靶标之间的距离远远超过抗体(2~3nm)的尺寸，确保不存在空间位阻。

12、我可以向已经完成整个染色过程并已储存的样品中添加其他抗体吗？

不可以，一旦组织被染色并固定抗体后，同一组织就不能进行第二轮染色。

13、组织与PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）荧光标记的reporter染料杂交后是否就固定？

不是的，组织切片被荧光报告基团的染色是一个可逆的步骤，可以在多各循环周期进行。

14、是否会出现在PCF空间单细胞蛋白组系统多周期运行过程中观察到信号或组织降解？对此是如何评估的？

在目前支持的多周期（35个周期）循环中，通过多次对相同两种抗体的多周期循环实验，尚未发现组织或信号降解现象，我们比较了不同周期图像的染色质量、信号含量和信噪比等参数。结果显示，不同的循环次数所产生的结果相似，并没有观察到信号或组织的降解。

15、PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）系统中，寡核苷酸序列与抗体偶联的长度是多少？

寡核苷酸序列的长度是专利信息。

16、有没有办法在不使用PCF空间单细胞蛋白组系统的情况下去除与Barcode连接的荧光基团？

荧光报告基团的去杂交过程是PCF空间单细胞蛋白组系统专有的，必须在本系统上进行。

17、如何确保抗体在PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）系统循环期间不会被去除？

在对组织进行抗体孵育后，染色方案有3个额外的固定步骤可确保抗体始终附着在抗原上，并且在PCF空间单细胞蛋白组系统的任何循环中都不会被去除。

18、是否可以在多次循环运行后重复使用已经结合了抗体的组织？

可以，结合抗体的组织可以重复使用2-3次。在PCF空间单细胞蛋白组系统运行期间，保持组织完整性。重复使用的能力取决于组织块的质量、组织类型、样品类型（FF/FFPE）、循环次数等；在对同一个组织样品重新运行多循环之前会执行“透明组织”方案

19、PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）是否允许共定位？

PCF空间单细胞蛋白组抗体允许共定位的可视化。

20、是否可以使用PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）方案进行细胞内染色？如果可以的话，是否需要更改某些步骤，例如添加透化处理步骤？

PCF空间单细胞蛋白组方案中有针对细胞内标志物的抗体，在我们推荐的染色方案中表现良好，不需要额外的透化处理步骤。

21、在PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）运行期间，是否需要执行空白循环？

我们建议用户至少执行两个空白循环以进行背景噪音的去除，尤其是在处理FFPE样品时。如果循环周期中有空通道，请使用“空”作为标记名称，而不是“空白”。

22、叠氮化钠的存在会影响抗体偶联反应吗？

叠氮化钠的存在不影响抗体偶联。

23、是否可以使用含有BSA的抗体进行偶联吗？

建议使用纯化的克隆（不含任何BSA和其他载体蛋白、甘油等）进行抗体偶联。BSA或其他载体蛋白的存在会影响偶联效率，因为抗体与寡核苷酸的比例至关重要，而BSA的存在会改变这个比例，并导致偶联效率降低。也有可用得BSA去除试剂盒，但它可能导致抗体丢失，并导致偶联所需的抗体少于50ug。因此请使用不含BSA的抗体clone。

24、PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）运行完成后，所获得的数据是什么格式的，有多大？

下机的数据格式为.QPTIFF格式的图像数据，可直接对图像的质量以及标志物的染色情况直接查看。根据组织大小和所使用的抗体数量，一次实验的数据大小可以是0.5~2TB。

25、不同类型和规格的组织芯片是否可以在PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）系统上使用？

可以，各种规格的组织芯片只要都是在成像范围内贴片都可以使用。

26、样本的自发荧光怎么处理？

PCF实验前后会获取样本的自发荧光，然后使用我们的算法扣除自发荧光。如果这种情况下，样本还有很高的自发荧光，可以在实验前对样本进行自发荧光淬灭的操作，可以参考免疫组化/免疫荧光样本处理。

27、PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）系统中是否有可用于脂肪细胞的抗体Marker？

目前还没有这种细胞类型的抗体Marker。

28、如果要检测的指标无法在一次循环中实现，每次循环出现空的通道PCF空间单细胞蛋白组系统可以这样运行吗？

实验时设置的每个cycle检测蛋白指标并不是每次都用满3个reporter。如果在一次循环中出现空的通道也可以运行。

29、PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）系统运行的时间会由于减少检测指标而缩短吗？

每次循环的用时包括添加reporter孵育的时间、扫描成像的时间以及洗脱reporter的时间，整体的用时更多的跟组织样本的大小有关。

30、PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）成像的分辨率能达到亚细胞水平吗？

目前PCF空间单细胞蛋白组的分辨率是250nm，达到亚细胞水平。