PhenoCycler-Fusion空间单细胞蛋白组学（简称PCF,原CODEX）FAQ

1. PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）技术如何运行？其原理是什么？

这个系统由三个部分组成，包括：1、试剂。试剂中包含对目标蛋白或者目标mRNA进行结合的抗体和荧光报告探针，以及相关的试剂、耗材；对于每一个要检测的目标蛋白，用一个针对这个目标蛋白的抗体，偶连上一段有特定 barcode 序列的 DNA 标签链。抗体部分负责识别目标蛋白，barcode 标签的DNA序列可以与报告探针的 DNA 链相互补从而被报告探针Reporters所识别。2、仪器。包括成像系统和杂交、清洗的液流系统；3、分析软件。软件可以把仪器获得的图像信息转变成单细胞的空间组学信息，从而进行进一步的数据分析。

具体的流程为：第一步，把检测的抗体 panel 与切片进行孵育。孵育的过程中抗体就会结合到相应的抗原上；第二步，开始进行第一轮的杂交显色。加入第一组3个荧光报告探针进行杂交，这3个探针针对3个不同的蛋白上结合的抗体，并且这3个探针分别发出不同颜色的荧光。杂交好之后，用显微镜对切片进行拍照成像。接下来，把第一轮结合上的报告探针洗掉。在这一轮的杂交中，检测到了3种蛋白。然后进入第二轮的杂交显色。加入第二组的3个荧报告探针。把杂交、拍照、洗脱的这个过程重复再做一遍。检测到第二轮的另外3种蛋白。再接着，做三轮、第四轮，第 N 轮的杂交显色。这样，经过多轮的杂交显色，就可以把一个 panel 中所针对的全部蛋白都检测到。

注：荧光检测的通道有4种：分别为647，550，750和488通道，其中石蜡切片的自发荧光比较强，尤其是488通道，所以石蜡样本不用488通道，只用于冰冻切片。

2. 细胞邻域作为PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）技术的一个新颖的亮点，为什么要做空间邻域的分析？它是如何发现（定义）的？

   技术和算法的进步允许我们识别新的空间关系，但确定其中哪些是组织行为的信息仍然具有最高的临床效用和挑战性，如免疫肿瘤微环境（iTME）是肿瘤、免疫、基质和细胞外成分的复杂组合，这些成分在细胞和组织空间水平上在抗肿瘤免疫中起着至关重要的作用。因此，基于组织内细胞类型的空间排列预测细胞-细胞相互作用网络（即what-where-how）正是其研究的价值所在。

细胞邻域的构建，即1.对于数据集中的每个细胞，使用其源组织内细胞的距离图来识别由索引细胞及其10个最近邻居组成的生态位（niche）或windows，识别邻居细胞的类型身份以揭示每个细胞的生态位组成。2.所有的这些window根据“窗口”中每种细胞类型的比例进行非监督聚类到clusters中。3.聚类后得到的组织类群根据细胞的X坐标和Y坐标信息进行模拟，展示为计算的细胞邻域在组织切片上的空间分布图。可作为新型的生物标志物为疾病治疗提供新见解。

注：为了对每种细胞类型的丰度差异进行归—化，对生态位组成niche进行了分位数归—化，并且成对相互作用的富集显示为给定细胞类型的所有细胞生态位的均值分位数。

3. PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）对不同组织的样本的要求是怎样的？包括样本的大小尺寸以及年限？以及适用的物种有哪些？

使用防脱片处理的载玻片，组织切片应完全粘在载玻片上，没有褶皱或撕裂。为确保组织切片不被损坏，关键是不要将组织切片堆叠在一起。对于样本的尺寸，厚度可尽量在4~10μm，成像面积大小为18*35mm，分辨率高达0.25μm/像素；样本量需求

对于样本年限，石蜡样本是否可用的评定标准主要根据免疫组化实验的可行性进行判断，新鲜冰冻的切片样本一般半年以内可用；适用的物种，人类中已有文献对多个不同部位的组织样本的应用案例研究，目前已验证的DNA偶联抗体具有72种，对于其他的样本如软骨组织需要脱钙处理，目前的应用案例没显示会影响蛋白的鉴定。小鼠中有25种在冰冻切片样本中已被验证切实可行（石蜡样本正在验证中）。

需要注意的是，目前大部分抗体不具有物种通用性，且小鼠的石蜡样本目前尚在验证。因此，对于非商业化的抗体如果想要尝试该技术流程，可以进行抗体偶联测试，但还是建议使用商业化抗体和冰冻样本。
4. 细胞邻域分析作为PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）技术分析的一大特色板块，对于细胞类型少的组织样本诸如血管组织细胞和神经细胞等是否也可以做细胞邻域的分析呢？

  可以，发现或者定义细胞邻域的过程中事实上是没有对细胞类型加以区分，主要依据的是非监督分类对组织细胞进行聚类来定义的。

5. PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）技术的优势如何？

快速，10分钟成像100万细胞；高通量，单周可以实现5-100张以上样本拍摄；高参数，单个样本同时进行100+蛋白标志物检测；

单细胞分辨率，高达0.25μm/像素（一般细胞在20~30μm大小，亚细胞分辨率小于10μm），可以任意组合并展示需要观察的蛋白；而根据细胞核染色进行的单细胞分割可以获得每个细胞完整的形态、空间位置、蛋白质组表达水平信息等数据揭示功能性空间生物学特征；这种单细胞水平上的全片组织成像分析，对于一些稀有且在组织中占比较小的细胞也可以检测到；

空间多组学，同时支持蛋白和RNA组织原位检测（尚未投入使用），可以结合其他组学数据进行更全面的研究；超多重空间表型和功能分析，通过对全组织整张样本图像的无偏差记录允许我们可以任选区域、任意marker组合进行分析，检测不同部位、多种细胞类型，进行空间表型分析和细胞空间关系分析。

6. PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）技术如果要定制的4个抗体，有3个647和1个550，这样是否可行？如何开展实验？时间上会由于减少检测的指标而缩短吗？

    如果一定要检测这个蛋白指标的话也可以上机测试，实验时设置的每个cycle检测蛋白指标并不是每次都用满3个reporter。实验开展根据原理，可以分为3个循环来完成，其中一轮循环检测两个目标蛋白，另外两轮循环各检测一种目标蛋白；每个cycle用时包括添加reporter孵育的时间，扫描成像的时间以及洗脱reporter的时间，整体的用时更多的跟组织样本的大小有关。

7.如果两个样本中每个细胞邻域内不同细胞亚型的富集比例不同，或者同一个细胞邻域在两种疾病之间其数量和细胞数目都不一样，这种情况下PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）怎么比较？

    对于同一种细胞邻域，基本上主要的细胞成分是一致的。不同样本间的比较，可以统计每一种细胞领域的在整个样本占比是多少，细胞邻域和邻域之间怎么样分布的，是否存在样本间差异。

8. 单细胞测序的数据如何与PCF空间单细胞蛋白组（原Codex）技术相关联并提升文章的档次？

   scRNA-seq要求细胞完整的从组织中回收并存活，很多研究不能进行多种细胞类型的研究，同时在很大程度上破坏了细胞的空间背景，不能为细胞的身份和功能分析提供信息。PCF空间单细胞蛋白组分析可使得组织内各种细胞的分布情况可视化，弥补了单细胞测序在原位信息呈现上的不足，如流式或CyTOF只是对表型比例的验证，无法获得细胞空间位置上的验证，以及多重免疫染色不是对单细胞水平的验证，可检测的指标也少，因而PCF技术则可以同时解决以上两个缺点更精确、全面的展示组织上细胞间的空间关系。

9. 不同类型和规格的组织芯片是否可用于PCF空间单细胞蛋白组？

   可以，各种规格的组织芯片只要都是在成像范围内贴片都可以使用。

   注：石蜡包埋组织芯片的局限性在于不能同时检测DNA、mRNA及蛋白质的改变，因为三者最佳固定条件不同，冷冻组织芯片可克服上述缺点但制作过程复杂，总体效果有待改进。另外，还可能存在一些无效组织、组织芯片的移位或脱落、假阳性或假阴性反应等问题。因此，对于该技术宣称的RNA检测仍有些疑问，如果是对同一张切片样本同时进行RNA和蛋白质的检测，如果是一些石蜡切片，那么尽管可以实现对多重蛋白指标的检测，但是其组织细胞内的RNA很有可能会发生降解。