PhenoCycler-Fusion空间单细胞蛋白组学（简称PCF,原CODEX）项目常见FAQ

1.空间单细胞蛋白组的局限性？

相比 bulk 水平的蛋白组价格高，但是相对于单细胞检测来说不贵。抗体有限（但是可以定制）。

2.空间单细胞蛋白组石蜡切片抗体是否也可以测冰冻切片？

不建议。有可能会做不出来，建议按照官网的推荐应用来做。

3.空单蛋有没有抗体通量上限？如果抗体可以连 barcode 预实验成功，是否理论上抗体种类可以无限增加？

目前文章中通常做 30-40 个左右抗体，美国做过 100 多种的。

4.空单蛋做大鼠样本有方法或者建议吗？是否定制抗体就行。

目前没有对应抗体，可以定制，但是成本太高，不建议，考虑用小。

5.空单蛋和 PBA 目前可以接联合分析吗，进行外泌体溯源供体细？

目前不建议。

6.PCF对照组的设计，一般怎么设计，常见的癌和癌旁，如果是单独对照组的样本，需要考虑切片位置问题吗？怎么考量？

宏观上切取的组织时根据是医生病例上来决定的，分析的时候可以从“微观”上选择 ROI 即感兴趣的区域，例如实验组和对照组都选择中央静脉区域选择 100um 的区域进行分析，或者某一个或者某一类特定类型的细胞周围的100um的区域。

7.PCF与IMC相比的优势有哪些？

①成像面积。IMC一般选择ROI为1mm2进行检测，PCF可以一次实现 630mm2 (18mm×35mm)全片成像。以60芯的组织芯片为例，IMC的费用超过60万，而PCF的费用低于10万。

②检测速度&效率。PCF一天可以扫描 630mm2，IMC一般一天可测 4-5mm2，检测时间太长会对抗体稳定性等产生影响，因此，当关注面积比较大或者用组织芯片的 时候 PCF 更具有优势。

③PCF分辨率。虽然两者都能达到单细胞水平，但PCF分辨率更高，IMC 分辨率是1μm，PCF是0.25μm，对于亚细胞结构及细胞间隙的识别，PCF 优势更大。       

④成像真实性。IMC成像是每个点的组织被气化后通过CyTOF的质量检测器分析，再根据获得每一个点的质谱信息重建组织图像。而PCF是直接用显微镜对组织拍照获得的真实图像，即所见即所得。

⑤检测指标数。IMC信号强度较高的通道40个左右，而且具有边缘效应，有些通道信号弱，对表达量低的蛋白检测会受限制。因此当指标超过40个时，IMC的检测质量就会受影响，PCF采用3种高强度荧光替换的方式，针对人石蜡样本可同步检测100多个蛋白。

⑥PCF体系更优化，定制抗体更具优势。

⑦IMC采用激光点阵消融法，每个点阵间存在细微的间隔，空单蛋使用高分辨率显微镜成像，不遗漏组织上的每一个区域。

8.空间转录组与PCF空间单细胞蛋白组的区别?

①检测对象不同。

空间转录组是对数千种mRNA在组织原位上的表达进行分析，是从RNA层面定义细胞亚群，RNA反映的是调控过程，不是决定细胞的功能效应因子，其变化不一定会同步体现在蛋白质上。而蛋白质是生物功能的最终体现者。因此定义细胞的种类和功能，蛋白质层面的证据更为直接和准确。空间单细胞蛋白组可对数百种蛋白质在组织原位上的分布和表达进行分析(单细胞水平)，是从蛋白水平定义细胞亚类和细胞功能状态的有力工具。

②分辨率。很多空间转录组(例如10x、DSP)达不到单细胞分辨率，PCF空间单细胞蛋白组分辨率为0.25um，能够实现真正意义的单细胞水平。

③空单蛋更直接，如果研究目的就是分析重要的免疫细胞和肿瘤细胞或基质细胞间的关系，利用空单蛋的检测指标可以精确的聚焦在这些细胞类型的分析中。

④空单蛋可以无缝衔接空间转录组开展多组学联合分析。首先空单蛋发现感兴趣的细胞互作特征区域，连续切片ROI圈选发现的特征区域开展GeoMX DSP 空间转录组，揭示特征区域中不同细胞类型的基因表达谱。其次空单蛋在单细胞分辨率下定义细胞表型，因此空间转录组可以联合空单蛋对细胞进行注释。

9.单细胞测序与CyTOF的区别?

①检测细胞数量。单细胞技术是对3000-30000个细胞进行测序检测，由于检测的细胞数量较少，不一定能够反应出复杂组织中的细胞占比，对于罕见细胞亚群的分辨率也不够。如果再考虑人为取样偏差和组织异质性问题，就会严重影响单细胞测序的数据可信度。CyTOF 技术每次实验对多达100万个细胞的蛋白质进行检测，不仅细胞分型数据更为准确，对于与占比较小的细胞亚群也能够精确分析。

②检测对象。单细胞测序检测的是RNA 水平的，CyTOF检测的是蛋白水平。RNA反映的是调控过程，不是决定细胞的功能效应因子，其变化不一定会同步体现在蛋白质上。而蛋白质是生物功能的最终体现者。因此定义细胞的种类和功能，蛋白质层面的证据更为直接和准确。

③单细胞测序一般需要蛋白层面的验证，例如免疫组化、流式、CyTOF 等，从RNA层面有差异不一定在蛋白层面能验证出来。另外，单细胞测序筛选到的差异基因不一定能买的对应的抗体。

10.我们中心主要是再生障碍性贫血会进行骨髓组织活检，但是组织中脂肪细胞占比可能会非常高，在进行蜡块处理的过程中脂滴都被溶掉了，这样作为标本是否可用?

一般不影响实验。这种样本您自己做过免疫组化吗，是否容易脱片，做免疫组化没问题的话 PCF 就能测，抗体浓度可能要高一些。

11.我看PCF的技术好像主要是针对细胞表面抗原进行锚定的，如果一个细胞有多个抗原希望检测，是否会出现竞争、冲突或者干扰?

染色时我们采用循环染色的形式，每一轮最多检测3个抗体，三个荧光通道均不同。另外，每一轮检测的抗体也会有设计原则，如完全共定位的指标不能放在同一个循环里相邻的两个通道，不能放在相邻循环的同一个通道。可以避免出现冲突和干扰。

12.除了表面抗原，我们能否对细胞的膜蛋白、甚至是细胞内的蛋白进行检？

可以，我们商业化列表里也有一些胞质蛋白和核蛋白，如Ki67、TOX、HIFIA、GATA3等。也可以根据您的需求定制抗体。