空间代谢组学-空间代谢组项目FAQ

1.空间代谢组的工作流程是什么？

答：实验流程与技术流程如下图所示

2.常见的质谱成像技术MALDI-MSI和DESI-MSI的区别和优势是什么？

答：（1）MALDI-MSI的基本原理是将能吸337 nm或355 nm紫外激光的基质分子通过空气喷射或升华等沉积到组织切片上，并与切片表面的待测物混合形成共结晶，在激光照射下，过量的基质共结晶被激发或蒸发成气相，同时携带分析物进入质谱进行检测。它的优势在于比较适合于生物大分子分析，且灵敏度较高，分辨率可以达到5-100 μm。

（2）DESI-MSI在大气压下即可实现待测物分子的离子化和成像，基本原理是萃取溶剂在雾化气和电压的作用下形成电喷雾，并以一定角度喷扫样品表面，当二者接触时溶剂可以快速地将待测物溶解并形成带电液滴，随后带电液滴以合适的角度进入质谱进样口，从而被质谱检测。它的优势在于更适合于小分子分析，且不需要基质溶液，样品前处理简单，实验在常压下进行，操作方便，但它的分辨率为50-100 μm，对于远距离大体积样品的检测有一定难度。

3.空间代谢组学与传统的代谢组学区别是什么？

答：传统代谢组学主要阐述生物样本中含有的代谢物整体含量的变化规律，缺少空间维度的信息。质谱成像（Mass Spectrometry Imaging）即一种新型的分子影像技术，能够直接从生物组织中获得大量已知或未知的内源性代谢物和外源性药物等分子的结构、含量和空间分布信息。空间代谢组学（Spatial metabolomics）是整合质谱成像和代谢组学技术，对内源性和外源性代谢物的种类、含量和空间分布情况进行精准测定，从定性、定量、定位三个维度阐释生物学效应背后的物质基础，将组学信息从二维拓展至三维水平，从空间维度对代谢物进一步确认。

4.空间代谢组学的主要应用方向都有什么？

答：（1）医学领域：

不同组织器官在发育过程中的代谢调控机制；

探究某种疾病（肿瘤疾病、心脑血管疾病、肝病、神经性疾病等）发生和发展的分子机制；

药物在生物体内的组织分布信息以及疗效机制研究；

疾病的生物标志物筛选与疾病的分子机制。

（2）植物领域：

揭示植物代谢物的组织分布规律和生物合成机制，揭示特定代谢物的生物合成定位；

揭示植物组织器官在发育过程中的时空代谢特征；

植物在逆境下的代谢反应和抗逆机制；

植物与微生物的互作机制研究；

转基因、基因沉默、基因敲除后代谢物变化的机制研究。

（3）动物领域：

动物胚胎、组织和器官在发育过程中的代谢调控机制；

揭示代谢物在动物组织的分布规律。

5.空间代谢组学对生物学重复的要求是什么？

答：大/小鼠的生物学重复建议≥3个，大型动物的生物学重复建议≥5个，临床样本的生物学重复建议≥5个。

6.空间成像的分辨率和定性的准确性哪个更重要？

答：两个都重要。空间分辨率并非越高越好，客户需要选择能够满足自己研究目的，经费上又可控的空间分辨率。空间代谢组主要解决的是代谢物的空间定位问题，通过非靶向的方式获得具有空间异质性分布的m/z，后续针对目标m/z通过原位二级进行验证对代谢物进行定性标注。

7.空间代谢组学的样本可以保存多久？可以分批采样吗？

答：可以分批采样，样本在-80℃条件下可以长期保存，样本尽可能保存于低温冰箱深处并保持与空气隔离，可以有效防止外部水汽在样本表面凝结形成冰晶或者冻融导致样本结构形态产生变化。

8.可以直接送切片样本进行空间代谢组学分析吗？

答：可以，自制切片可以节省沟通时间，加快实验周期。需要注意的是空间代谢组学样本需放置于导电载玻片上，如自制切片请提前联系我们寄送导电载玻片，标准导电载玻片规格为2.5cm * 7.5cm，切片放置区域为下图红框标定的定位孔内。

9.什么样本可以做空间代谢组学分析？空间代谢组学可以做液体样本吗？

答：空间代谢组一般适用于新鲜的固体成型组织，不适合液体及不成型的样本。通常检测样本大小在10mm×10mm左右，载玻片大小25mm×75mm以下的组织。需要注意样本不能经过福尔马林浸泡、HE染色、荧光标记等处理。福尔马林固定会在样品中发生交联，使得它们无法用于电离，因此也不能是石蜡包埋（FFPE）的样本。同时，样本准备过程中不可使用OCT（optimum cutting temperature compound）包埋剂，OCT中的聚合物在离子电离时会产生干扰峰，从而影响代谢物检测。

10.空间分辨率大小在生物样本分析中的意义是什么？

答：空间分辨率越小越容易发现独特的代谢群体，同时分辨率越小越容易检测到具有独特代谢模式的细胞亚型或者区域，也可以避免受到其它细胞群体覆盖，解释组织代谢的异质性。例如50μm空间分辨率成像单个像素大小为50μm*50μm，即每个像素点约是25个细胞的平均代谢物信息，100μm空间分辨率的每个像素约是100个细胞的平均代谢物信息。

11.临床样本尺寸比较大,如何确保选取的组织是病灶部位？是根据HE染色吗？

答：是的，通过HE染色。做空间代谢组学在上机前，我们都会对一张切片进行HE染色，确定了结构后才会将连续切片上机进行扫描以及后续的分析。且对于肿瘤组织做空间代谢组，客户无需将癌和癌旁分割后再送样，可以利用空间代谢组对一整块的组织（包括癌和癌旁）实现同时成像。

12.空间代谢组学如何发现关键代谢物分子？

答：（1）进行代谢物分子空间共定位分析

空间共定位分析是一种代谢物的空间相关性分析，选择一种目标代谢物后，进行空间相关性计算，输出与目标代谢物空间表达趋势一致的代谢物List，可以帮助开展对该区域中代谢物表达模式和代谢网络的分析工作。

（2）代谢物统计学差异分析及生物信息学分析

本部分主要针对代谢物含量开展单维与多维统计学分析、KEGG通路分析、表达量相关性分析、聚类热图、代谢物分类等分析。在空间代谢组学中，该分析目标是指定区域或者切片，当选择好目标区域后，通过算法整合区域中的代谢物含量后，开展后续分析。

代谢物差异分析结果示例图

13.空间代谢组和传统LC-MS代谢组的离子峰数有什么区别？

答：空间代谢组学中的离子峰数是分析整张切片过程中所有被检测到的离子峰数量。空间代谢组图像中的每个像素点由质谱成像系统独立检测产生，所以每个像素点都会有自己相应的代谢组信息，选择不同的区域（像素集）会对应不同的离子峰数量。而传统的LC-MS代谢组一个样本上机检测到离子峰的数量是固定的，两者是有一定区别的。

14.结果输出的离子峰数量是不是越多越好？

答：不是，虽然检测到的离子峰数量是评价空间代谢结果的重要指标，但空间代谢组学检测中很大一部分离子峰源自噪音和离子碎片，该类峰没有实际意义，属于无效峰，所以只计算总离子峰数量没有意义，需要对信息进行筛选过滤处理。

15.空间代谢组学常见的数据分析内容有什么？

答：通过对空间代谢组学检测到的质谱成像数据进行数据处理后，会进行以下分析：

（1）质谱分析（平均质谱图、物质鉴定、代谢物种类评估、空间分割分析）；

（2）空间成像分析（UMAP分析、t-SNE降维分析）；

（3）差异分析（代谢物空间分布差异分析、微区差异分析和组间差异分析）；

（4）常规代谢组学分析（多元统计分析、KEGG分析及生物信息学分析等）。