双光子显微成像介绍--光纤在其中的作用--光路设计

路人甲ing..

于 2024-12-02 16:11:42 发布

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分类专栏：光学成像文章标签：成像计算成像双光子成像光纤扫描微生物监测

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Scanning Two-Photon (2P) Fiberscopes（也称为endomicroscopes）是用于活体成像的高分辨率光学设备，结合了光纤技术和双光子激发荧光显微成像技术（Two-Photon Excitation Microscopy, TPEM）。

A 基础介绍

一、基本原理

双光子显微成像是一种非线性光学显微技术，其核心在于利用两个低能量光子（通常是近红外光）的同步吸收来激发荧光分子。与单光子成像相比，它具有以下特点：

红外光的高组织穿透性：由于使用近红外光，组织散射和吸收减少，使得成像深度更大。
局域激发：只有聚焦点处才能同时吸收两个光子，激发荧光，减少焦点外的光漂白和光损伤，提高信噪比。

光纤扫描技术使得双光子显微成像小型化成为可能：

单根或多根光纤传输光信号：将激发光通过光纤传输至样品，收集样品的荧光信号。
光学扫描装置（例如MEMS镜或压电扫描器）：通过光纤或微型镜头的机械振动实现光束扫描。
探头设计：直径可缩小至几毫米，可插入体内进行成像。

二、学术研究进展

早期研究：
双光子显微镜在20世纪90年代被发明，随后成像系统不断改进。2000年代后期，扫描光纤技术和MEMS技术的引入推动了2P fiberscope的快速发展。
成像深度：
当前的2P fiberscope可以穿透1毫米以上的组织，用于大脑、皮肤等深层组织成像。
高效荧光探针：
新型荧光染料和纳米粒子设计提高了荧光信号的强度和光稳定性，进一步增强了成像效果。
实时成像：
高速扫描技术（如基于压电扫描器的高速振镜）可以实现每秒数十帧的实时活体成像，应用于神经活动、血流和药物扩散的动态研究。
便携化与植入：
2P fiberscope的尺寸和重量显著减小，使其成为便携式或植入式设备，特别适用于小动物实验（如活体啮齿动物的大脑研究）。

三、研究方向

神经科学：
- 在活体动物中监测神经元活动：研究功能性神经网络和突触活动。
- 与光遗传学结合：通过2P fiberscope与光遗传学工具的结合，研究神经网络的刺激与响应机制。
肿瘤学：
- 体内肿瘤微环境的研究：观察肿瘤血管、免疫细胞和癌细胞之间的动态相互作用。
- 活检指导：2P fiberscope用于精准定位和活检引导。
药物筛选：
- 在小动物体内测试新药的分布、代谢和疗效。
组织再生与修复：
- 观察干细胞分化和组织修复过程，如皮肤愈合和骨再生研究。
工程化方向：
- 优化光纤的传输效率，提高成像深度和分辨率。
- 开发小型化的超高速扫描装置，以进一步提升便携性和实时性。

四、商业化程度

当前的市场情况：
- 目前已有多家公司推出了商用的2P fiberscope系统，如Inscopix 和 Femtonics 等公司，主要用于科研市场。
- 此类设备多作为定制化解决方案提供给实验室，具有较高的灵活性和可扩展性。
关键组件：
- 激光光源（飞秒激光器）价格高昂，仍是成本的主要来源。
- 高灵敏探测器（如光电倍增管）和扫描设备技术门槛较高。
商业化挑战：
- 成本较高，主要限制在科研领域；
- 医疗应用中需要通过严格的监管审批，研发周期长。

五、售价

商用的2P fiberscope设备通常价格在50,000至200,000美元不等，具体价格取决于以下因素：

激光器性能（波长范围、脉冲宽度等）；
探头的尺寸和设计复杂性；
扫描速率和图像分辨率；
配套的软件和数据处理能力。

对于高性能系统，特别是需要深度成像和快速动态捕捉的设备，价格可能更高。此外，科研用户通常还需要定制化服务，这会增加总成本。

在 Scanning Two-Photon (2P) Fiberscopes 中，光纤是系统中关键的光学传输组件，通常使用特殊类型的光纤以满足双光子成像对高功率传输、非线性效应抑制以及光束质量的要求。以下介绍光纤的类型及其作用。

B 采用的光纤类型和作用

一、光纤类型

单模光纤（Single-Mode Fiber, SMF）
- 特性：
  - 只支持基模（LP01模式）传播，能保证光束质量。
  - 光束的空间分布高斯型，有利于聚焦到小点。
- 用途：
  - 在较长距离下传输激发光。
  - 提高光纤的耦合效率并减少色散。
多模光纤（Multi-Mode Fiber, MMF）
- 特性：
  - 允许多个模式传播，核心直径较大（通常在50-100 μm）。
  - 容易出现模式干涉，但可以传输更高的光功率。
- 用途：
  - 用于激发光传输，但多模光纤需要配合波前整形技术（如自适应光学）以修正模态畸变。
保偏光纤（Polarization-Maintaining Fiber, PMF）
- 特性：
  - 能维持线偏振光的偏振态，避免偏振干扰。
  - 适用于偏振敏感的光学系统（如二次谐波产生或偏振控制）。
- 用途：
  - 稳定激发光的偏振状态，减少信号损耗。
大模场面积光纤（Large-Mode Area Fiber, LMA Fiber）
- 特性：
  - 核心较大（几十到上百微米），允许更高的功率传输。
  - 抑制非线性效应（如拉曼散射、四波混频等）。
- 用途：
  - 用于高功率飞秒激光传输，避免光纤中非线性效应对脉冲的畸变。
空芯光纤（Hollow-Core Photonic Crystal Fiber, HC-PCF）
- 特性：
  - 激光在中空的空气通道中传播，非线性效应进一步降低。
  - 色散特性更易于控制，适合短脉冲激光传输。
- 用途：
  - 用于超快激光传输或深组织成像的特殊应用。

二、光纤的作用

激发光传输
- 激光光源通常是大型飞秒激光器，通过光纤将激发光传输到探头末端。
- 光纤需确保激光高效耦合传输，并保持光束的空间模式（单模或高质量模式）。
荧光信号收集与传输
- 从样品处收集到的荧光信号可以通过光纤传输到探测器（如光电倍增管或硅光电二极管）。
- 这种传输需要光纤具备较高的信号透过率和低损耗特性。
探头小型化的实现
- 通过使用微型化的光纤探头，可以使设备直径缩小到毫米级，从而实现高分辨率的体内成像。
- 光纤还可用于耦合扫描装置（如MEMS镜）和探头光学系统。
波前整形
- 多模光纤或复杂光纤系统可能导致激光波前的畸变，波前整形设备（如自适应光学）常与光纤结合，以提高聚焦性能。
高功率激光的传输
- 双光子显微技术依赖于高峰值功率的飞秒激光，光纤必须能够承受这些高功率而不产生过多的非线性效应或损伤。
稳定偏振状态
- 对于某些需要偏振敏感的成像技术（如二次谐波成像），光纤需保持光的偏振态以避免信号劣化。

三、光纤的设计与限制

模式畸变与补偿
- 多模光纤易引入模式干扰，可通过自适应光学或数字光处理技术进行补偿。
损耗与效率
- 光纤材料对特定波长的激发光和荧光的透过率需要优化，以减少传输损耗。
非线性效应
- 在高功率飞秒激光传输中，光纤非线性效应（如自相位调制、四波混频）可能导致激发光脉冲畸变，需要通过选择合适的光纤类型来抑制。

四、未来方向

多通道光纤探头：实现同时激发多种波长或探测多种荧光信号。
柔性光纤探头：开发可弯曲、可植入的柔性探头，用于大动物或人体研究。
超低损耗光纤：改进光纤材料以进一步降低光损耗，提升成像深度和分辨率。

C 成像原理和典型光路图

Scanning Two-Photon Fiberscopes 的成像机理结合了 双光子激发荧光成像 和 光纤扫描 技术，其成像流程与光路示意可以分为以下几个部分来解释：

一、成像机理

1. 双光子激发荧光（Two-Photon Excitation Fluorescence, TPEF）

激发原理：飞秒激光器发射的近红外光（NIR，通常700-1000 nm波长）通过光纤传输到样品。样品中荧光分子吸收两个低能量光子的能量，并发射单个高能量光子（波长较短的荧光，如绿光或蓝光）。
焦点激发：由于双光子吸收概率与光强的平方成正比，仅在焦点处产生荧光，这一特性实现了三维分辨能力。
优势：减少光漂白和组织损伤，同时能在活体组织中深入成像（通常可达500-1000 μm深度）。

2. 光纤扫描

激光传输：激发光通过单模或多模光纤到达探头的微扫描装置。
扫描机制：使用MEMS微镜或压电扫描器振动光纤，驱动激发光进行二维或三维光栅扫描。
荧光信号收集：荧光信号通过光纤或独立的收集通道返回到检测器。

3. 检测与成像

通常不需要使用传统的CMOS摄像头，而是利用光电倍增管（PMT）或光电探测器来收集荧光信号。这是因为：
- CMOS相机通常用于宽场成像，而2P系统需要逐点扫描。
- PMT灵敏度更高，能够捕捉微弱的荧光信号。
数据通过控制系统重建成像，形成高分辨率的二维或三维荧光图像。

二、光路示意

以下是典型的光路结构，可以用图示表达：

1. 激发光路径：

激光器：发射飞秒脉冲的近红外光。
光纤耦合器：将激光耦合到单模光纤（或多模光纤）。
光纤：传输激光到探头。
探头扫描装置：MEMS振镜或光纤尖端的振动结构，用于控制激光扫描。

2. 荧光信号路径：

样品：荧光分子吸收激发光并发射荧光。
收集光路：
- 若使用独立光纤，荧光通过光纤返回。
- 若使用同轴设计，激发光和荧光信号共用一根光纤。
滤光片：分离激发光和荧光信号（阻挡激发光，允许荧光通过）。
探测器：荧光信号到达PMT或光电探测器，转换为电信号。

3. 数据采集和处理：

信号重建：通过控制系统，将扫描位置和探测到的荧光信号结合，形成二维图像。

三、是否需要CMOS摄像头？

不需要传统的CMOS摄像头：

在扫描型2P显微镜中，成像通过点扫描机制完成，不是同时采集整个视场的信号。
CMOS适用于宽场显微镜，而2P fiberscope更依赖高灵敏度的PMT。

四、光路结构示意

以下是扫描两光子纤维显微镜的光路结构简化图：

             激光器
               ↓
        [光纤耦合器]
               ↓
            [光纤]
               ↓
  ┌──[探头]──[扫描装置]──┐
  ↓                     ↓
[样品]          [荧光信号收集光纤]
  ↓                     ↓
  └──────────[滤光片]───┘
               ↓
        [光电探测器]
               ↓
       [信号采集与重建]
               ↓
           [成像输出]