实验心得_大肠杆菌原核表达实验心得（上篇）

大肠杆菌原核表达实验心得（上篇）
对于大肠杆菌蛋白表达，大部分小伙伴都觉得 so easy! 做大肠杆菌蛋白表达十几年经历的老司机还经常阴沟翻船，被大肠杆菌表达蛋白虐千百遍的惨痛经历，很多小伙伴都有切肤之痛。
福因德接下来陪你聊聊大肠杆菌表达重组蛋白里面的弯弯道道，拿到一个项目，我们要从以下方面入手。1. 蛋白基本性质分析
所谓知己知彼百战不殆。如果不熟悉其性质，随便找一篇文献或者问问师兄师姐照葫芦画瓢，找一个载体随便上，这样如果成功纯粹就是碰运气。我们经常碰见这样的案例，一个氨基酸的突变极有可能造成蛋白表达的不成功、表达状态改变或者降解加速。
那我们分析蛋白质的性质，该从何下手呢？很多初学者往往一头雾水。我们主要从蛋白质分子量、亲水性、蛋白质修饰情况、蛋白跨膜区、蛋白质等电点、蛋白质在本物种体内的存在环境以及是否是酶等等。1）分子量：分子量太大或太小都不易表达。分子量太小容易降解，太大不易表达，任何一个位置氨基酸或者结构有问题，都会影响整个蛋白。2）亲水性：一般来说亲水性较好的蛋白比较易于表达，并且容易可溶性表达，这个亲水性可以通过软件预测，比如 DNastar 的 Protean（软件及其使用方法，可以联系 QQ657047932 索取）；通过这个软件我们同时可以看到蛋白抗原性预测基本与这个亲水性趋势一致，所以准备拿这个蛋白制备抗体的小伙伴是不是很开心？3）蛋白质修饰情况：在 Uniprot 网站查到这个蛋白之后，这里面信息量很大，如果蛋白修饰比较多的话，这个蛋白不容易表达或者表达的状态不容易为上清可溶性，原因是大肠杆菌内表达这个蛋白是没有修饰的，蛋白的修饰与不修饰，理化性质肯定是不同的，这些都会使你的原核表达遇到障碍。4）蛋白质跨膜区：跨膜区域一般是亲脂疏水的，这些部分多了对蛋白的顺利表达极为不利；即使蛋白可以顺利表达，下游纯化也是极为不利。5）蛋白质等电点问题：如果溶液环境与蛋白质等电点相同或者接近，蛋白质非常容易沉淀。6）蛋白质在本物种体内的存在环境：环境变了，蛋白质很可能「水土不服」，某个蛋白在同一个个体，不同部位，不同发育时期，其变现状态有可能都大不相同，这些不同包括修饰位点和程度，蛋白序列长短等等；普通大肠杆菌细胞内这个溶液环境是还原性的，对于需要二硫键对接的蛋白根本完不成这个使命，需要格外注意。7）蛋白本身是否是酶或者活性蛋白：如果你的目标蛋白本身是酶或者活性蛋白，不但自身不稳定还会「惹事生非」，我们有时候称她们为「毒性蛋白」，这个时候一般会选用极度严谨型表达。
下篇我们继续讲大肠杆菌重组表达表达策略问题...