TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒使用说明书.PDF
TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒使用说明书
(通用型,适用于细胞、组织样本)
【试剂组成】
组 份 规格:20T 规格:50T 规格:100T 储存条件
平衡液 1.0 mL 2.5mL 5.0 mL -20℃
TdT酶 80μL 200μL 400μL -20℃
50×蛋白酶K 40μL 100μL 200μL -20℃
Streptavidin-HRP 10μL 25μL 50μL 4℃避光
Biotin-dUTP 20μL 50μL 100μL -20℃
DAB 2mg 5mg 10 mg -20℃避光
【技术背景】
TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况,其原理细
胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡
时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNAladder。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH
可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TerminalDeoxynucleotidylTransferase,TdT)的催化下加上生
物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP),随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin
(Streptavidin-HRP)结合,最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞,从而可以通过普
通光学显微镜检测到凋亡的细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有
3'-OH形成,很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)法检测细
胞凋亡的原理。
本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)的凋亡原
位检测。
【注意事项】
① 使用前请认真阅读本说明书,提前准备好相关试剂。
② 因本试剂盒中组分均为微量,使用前请离心集液。
③ 为避免试验误差、降低试剂的损耗,建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
④ TdT酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制,再分别滴加于各样本片上,避免
每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
⑤另因DAB为固体粉末,使用前加入适量PBS 溶解,配制成20×DAB(10 mg/ml)后,按
下述方法显色使用。
⑥用户自备:二甲苯、多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染
染液:苏木素或甲基绿等;盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、光学显微镜、37℃孵箱、
移液器等。
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【样本预处理】
TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在,本说明书推荐的条件仅为普遍情况,用户需
根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件,如处理时间、处理浓度等,来优化出适合
自身样本的试验条件,从而做出客观的试验结果。
1、对于细胞样本
a、 把准备好的细胞涂片或爬片自然晾干。
b、 把晾干的样本浸入固定液,室温(15-25℃)固定15-60min。
(固定液的配制:4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中,需新鲜配制)
c、 把固定好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
d、 把c步处理好的样本浸入封闭液中,室温(15-25℃)封闭10min。
(封闭液的配制: 3%HO溶于无水甲醇)
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e、 把d步处理好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5min。
f、 把e步处理好的样本浸入通透液中,冰上(2-8℃)促渗2min。
(通透液的配制:0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠,