调焦后焦实现不同距离成像_是什么保障一次成功的活细胞成像？

活细胞成像解决方案

前言

活细胞成像很吸引人的一点就是，得到图像时细胞是活的，图像实时反映了细胞内的状况，如果能在一段时间内连续成像，就可以记录到细胞的一个动态变化过程，更有助于揭示生命本质。正所谓有图有真相，更多的图有更深刻的真相，更多连续的图组成一个故事。 

活细胞视频1 

现在我们分析一下为了实现活细胞成像需要哪些条件：

1. 细胞活着，在整个成像的过程中都要保证细胞活着，而且还要活得舒服(除非你的实验目的就是研究细胞的死亡过程)。

2. 拍到好图片，而且要连续不断的拍到好图片。

3. 最好操作简便，稳定可靠，这样才能保证实验人员心情舒畅，以更饱满的热情献身科研事业。

那么显微镜工程师们究竟设计了怎样的解决方案呢？

在本文中，应用专家将从细胞生存环境控制组件、成像条件控制组件以及易用性组件三方面为您揭秘。一切复杂设计，只为您最方便地实现最准确的活细胞成像。

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活细胞成像技术可以实时或者在一段时间内以影像方式记录细胞内部结构变化和细胞生理过程。与固定的照片相比，对于动态变化的记录可以分析得到更多信息，使人们对细胞的运作过程的认识更加深入。

本文旨在介绍现在可以为活细胞成像实验提供的硬件和软件解决方案，为有意进行相关实验的研究者提供参考。

活细胞成像系统包括以下组件

细胞生存环境控制：

温度：载物台加热，顶盖加热，物镜加热；大温控箱

湿度：加湿器

气体控制(二氧化碳或氧气)

成像条件控制：

焦面控制：软件自动对焦bestfocus，焦面稳定系统AFC，精确定焦closeloop

自动补水

易用性组件：

远程监控

电动矫正环

1 细胞生存环境控制组件

图1  配有小培养室温控插件的活细胞成像系统

1.1温度控制

活细胞成像时细胞是放置在载物台上，需要控制细胞周边环境的温度，现在有两种解决方案：一是用放在载物台上的小培养室插件，分别对载物台、培养室顶盖和物镜进行加热(图1)；二是用大温控箱，将整个载物台、物镜及转盘、聚光镜等部分包括在内，通入恒温的空气，对整个系统进行保温(图2)。

图2  配有大温控箱的活细胞成像系统

载物台加热模块通过热传导给样本保温，顶盖加热模块一方面可以通过热辐射给样品保温，使加热更均匀，另一方面可以避免水雾的凝结在顶盖上，影响透射光的成像。

对于使用水镜或油镜成像的实验，因物镜通过介质与样本接触，物镜的温度会对样本有较大影响(图3)，需要配物镜加热模块(图4)。

图3  物镜加热的温度图像(引自Tokaihit)

图4 物镜加热模块及其系统组成示意图

小培养室插件系统装配方便，在不需要时可以方便的拿下，小环境控温也比较快速精细，缺点是对不同的培养器皿需更换不同的适配插件。

大温控箱通过通入不断流动的恒温空气，对整个系统进行保温，无需单独的顶盖、物镜、载物台加热模块。优点是解放了载物台周围空间，可以比较灵活的使用各种细胞培养容器，搭建显微操作或加样、灌流装置，也可以选用不透光材料做成暗室，缺点是封闭空间不利于便捷操作，另外达到恒温所需的时间比较长，实验前需要提前较长时间开启。

图5   大温控箱系统组成示意图

1.2 湿度控制

细胞培养中，环境的湿度影响的是培养液的蒸发速率，图6所示的是25mm平皿中液体在37℃不同空气湿度情况下的蒸发速率。湿度越高，蒸发越慢。

图6  无盖35mm平皿中的液体暴露在37℃不同湿度空气下的蒸发速率

 如果培养中的细胞培养液蒸发，会导致培养液离子浓度和渗透压升高，影响细胞的状态(图7)

图7  溶液离子浓度对细胞的影响

 所以，对于较长时间的成像实验，必须选用加湿模块，提高环境湿度以减少蒸发，从而保持培养液离子浓度稳定。常用的加湿模块一是采用水槽加热的方式(图1)，直接在小培养室内设水槽，底部加热使水蒸发以保持湿度；另一种是对通入培养环境的气体预先加湿(图8)。

图8 加湿瓶

1.3 气体控制

对于多数培养中的哺乳动物细胞，需要保持环境中保持5%浓度的二氧化碳，在活细胞成像实验中，实现的方式有两种，一是直接购买二氧化碳浓度为5%的预混气，装于钢瓶中，通过减压阀恒流器调节后通入培养环境，这种方式购买时设备投入较少，但是预混气体的成本较高；二是购买纯二氧化碳气体，经过一个二氧化碳控制器，与空气混合调节浓度到5%后，通入培养环境，对于特殊要求的样本，还可以调节到其它浓度。不像细胞培养箱有二氧化碳浓度感受器探测箱体内二氧化碳浓度来反馈调节，活细胞成像系统不探测培养室内的二氧化碳浓度，只检测控制器内混合后的气体浓度稳定，通过不断的向培养环境供气来是培养环境气体浓度稳定。

图9 配备小培养室插件时的二氧化碳浓度控制系统示意图

如果是配备大温控箱的系统，因为大温控箱容积较大，而且不断有热空气通入，气体更换速度快，如果直接将调好二氧化碳浓度的混合气通入整个温控箱会难以达到稳定浓度，所以需要在培养的细胞上方加一个罩，气体通入其中，创造一个小体积的局部环境，便于浓度稳定(图10)。

图10配备大温控箱时的二氧化碳浓度控制系统示意图。如果是要求低氧环境的样本，在供气的要求上需要一个能同时检测氧气浓度的控制器，同时需要购买压缩的氮气作为气源来代替空气。

2 成像条件控制组件

2.1 焦面控制

我们知道，显微成像对于聚焦的要求很高，我们找到标本的某一焦平面之后，希望能够稳定在这一层面，记录标本随时间的变化。然而在长时间的成像实验中，整个系统会不可避免的受到外界的干扰：如震动导致的偏移，重力长时间作用导致的物镜下沉，热胀冷缩导致的相对位置变化，细胞本身的移动等。为了解决这些问题，我们推出了以下三种方案：

(1)软件自动对焦bestfocus：这个是基于软件的解决方案，原理是在软件里设定，在每一次正式拍照前，先在当前焦平面的上下各一定的范围内快速预拍一系列照片，软件根据一定的算法对这些照片进行分析，选择最清晰的一张，然后在其所在焦距位置进行正式拍照。

此方法的优点一是可以追踪细胞本身移动导致的焦平面变化，二是不需要添加额外硬件，且由Leica免费提供，成本最低。缺点一是预拍照会消耗一定的时间，增加对标本的照射，可能会对标本产生影响，二是软件根据算法分析出来的最佳焦面可能不是我们想要的。

(2)焦面稳定系统AFC：这个是基于硬件的解决方案，需要显微镜配置相应的硬件。原理是(图11)：由物镜下方的LED光源发出一束红外光，穿过物镜照到标本，在标本下方的玻片和培养液界面发生反射，反射的光透过物镜被检测器检测，当物镜与标本的距离变化时，在玻片和培养液界面反射的光线就会发生变化，探测器探测到的信号模式也就发生变化，所以分析探测器探测到的信号就可以知道物镜与样本的距离，工作时，软件会自动调焦以保证探测器探测到的信号保持一致，那么物镜与样本的距离就保持一致，拍照得到聚焦位置也就保持不变。

此方法的优点一是准确，无论是热漂移还是重力漂移，都能保证成像焦面不受影响。二是快速，对焦在瞬间完成，三是不会增加对样本的照射，LED所发出的红外光非常微弱且对样本影响较小。缺点是需要额外硬件，且不能纠正细胞本身移动造成的漂移。

图11  AFC原理示意图

(3)精确定焦Close-loop：为了进一步提高对焦精度，使重复在同一焦面位置拍照时物镜能更准确的到达预定位置，减少误差，Leica公司在新推出的DMi8显微镜上实现的新技术(图12)。

图12  close-loop 功能分别关闭和打开时，物镜分别上行和下行并在各位置拍照，对所的图像测量得的荧光亮度变化。可以看出，close-loop功能打开时能得到更好的一致性。

此方法的优点是大大提高的对焦的精度，是的实验重复性更好。缺点是仍需要添加额外硬件才能实现。

这三种方法各有优缺点，一般推荐结合使用，以便适应各种不同的实验，达到最好的效果。由AFC稳定焦平面位置，Close-loop保证位置的精确，bestfocus应对细胞漂移的情况。

2.2 自动补水

水的折射率与培养液相近，活细胞成像时使用水镜物镜能获得最好的成像效果，因此一些对图像质量要求较高的实验比较适合使用水镜。水镜成像时必须要在物镜和标本中间加水，水比较容易蒸发，尤其是长时间的活细胞实验，需要不断的加水。因此，配备一套物镜自动补水系统就十分必要了(图13)。

图13物镜自动补水系统

3 易用性组件

3.1 远程连接

对于持续时间长的的活细胞成像实验，实验者一般不太可能一直守在设备旁边，比如非常重要的过夜的实验，实验者下班回家时可能都在担心实验的情况，还有在外地出差的实验室负责人可能也会非常关心实验进行的情况，所以远程连接就变得十分必要。当活细胞成像进行的时候，您在任何地方，任何时候都可以通过移动设备与实验设备保持联系，可以从移动设备上查看、开始、暂停、停止实验的图像和环境条件，非常实时直观的知道实验结果。

图14  远程连接和环境条件监控软件界面

3.2 电动校正环物镜

有些带校正环的物镜，可以针对不同材质和厚度底部的培养器皿进行校正，得到完美的图像，但是有过使用经验的研究者会发现，在成像时物镜位于样本下方，不太容易用手够到，调节的时候还会引起图像晃动，需要一定的技巧才能调到最佳。如果物镜配有电动的校正环，就可以在软件界面进行调节，非常的简便精确(图15)。

图15  物镜电动矫正环和软件调节界面

小编结语

有了细胞生存环境控制组件、成像条件控制组件以及易用性组件这三方面的精心保障，您的细胞保持勃勃生机，个个都是超级模特，拍出美美的照片。