流式双染凋亡率的计算_Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡

看到来我们眼科公共平台来使用Fortessa检测凋亡时，看到很多人都是泪流满面，鉴于此，作者大找网络资源结合自己的理解，针对普遍的问题给眼科的童鞋们一个交代，期待对大家有用，期待大家板砖！！

Reference

1. Galluzzi L, Aaronson SA, Abrams J, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ2009; 16:1093-107.

一、原理       在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(FITC)标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞早期凋亡的发生。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI(7-AAD也可以)匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、注意事项

1． Annexin V-EGFP，Propidium Iodide (PI)避光保存及使用。

2． Propidium Iodide (PI)有毒，操作时要戴手套。

3．推荐使用悬浮培养细胞，如果是贴壁细胞，用胰酶消化不当，会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。

4．因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节

5.Annexin V染色的常见特性，即使未凋亡的细胞(Annexin V-7-AAD-细胞)，经过染色后在流式图上的位置也会右移，这是正常现象大家不要奇怪。有人曾经试图通过洗去多余抗体来将活细胞群(Annexin V-7-AAD-细胞群)调整到我们通常认为的“阴性细胞”位置，行不通。并且洗过之后，各群细胞比例已经发生改变了。

6.要特别注意在FSC/SSC圈门时，所选细胞范围会对结果造成较大影响，大家自己分析的时候就会发现这一点，所以小伙伴们在分析的时候要把所有分析对象都圈进FSC/SSC的门内，这样才能反映真实情况。

7.本法的优点在于无需固定细胞、染色快速，但是缺点是当细胞膜破裂时Annexin V也可与细胞结合，而且在一些自噬受损的细胞中，PS外翻可能受阻，所以此时Annexin V就不再适合用于早期凋亡检测了。