看到来我们眼科公共平台来使用Fortessa检测凋亡时,看到很多人都是泪流满面,鉴于此,作者大找网络资源结合自己的理解,针对普遍的问题给眼科的童鞋们一个交代,期待对大家有用,期待大家板砖!!
Reference
1. Galluzzi L, Aaronson SA, Abrams J, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ2009; 16:1093-107.
一、原理 在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(FITC)标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞早期凋亡的发生。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V与PI(7-AAD也可以)匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、注意事项
1. Annexin V-EGFP,Propidium Iodide (PI)避光保存及使用。
2. Propidium Iodide (PI)有毒,操作时要戴手套。
3.推荐使用悬浮培养细胞,如果是贴壁细胞,用胰酶消化不当,会引起假阳性,而用细胞刮子会造成细胞粘连成团,而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中,防止进一步的损伤。
4.因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同,因而流式检测的荧光补偿也不同,因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照,进行荧光补偿的调节
5.Annexin V染色的常见特性,即使未凋亡的细胞(Annexin V-7-AAD-细胞),经过染色后在流式图上的位置也会右移,这是正常现象大家不要奇怪。有人曾经试图通过洗去多余抗体来将活细胞群(Annexin V-7-AAD-细胞群)调整到我们通常认为的“阴性细胞”位置,行不通。并且洗过之后,各群细胞比例已经发生改变了。
6.要特别注意在FSC/SSC圈门时,所选细胞范围会对结果造成较大影响,大家自己分析的时候就会发现这一点,所以小伙伴们在分析的时候要把所有分析对象都圈进FSC/SSC的门内,这样才能反映真实情况。
7.本法的优点在于无需固定细胞、染色快速,但是缺点是当细胞膜破裂时Annexin V也可与细胞结合,而且在一些自噬受损的细胞中,PS外翻可能受阻,所以此时Annexin V就不再适合用于早期凋亡检测了。