细胞凋亡实验步骤

实验方法原理     

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

 

流式细胞仪激发光波长用488 nm,用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560 nm的滤器检测PI(双链DNA荧光染料)

 

凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是晚期凋亡细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为早期凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。

 

碘化丙啶可以染色坏死细胞凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞,呈现红色荧光。对于坏死细胞,由于细胞膜的完整性已经丧失,Annexin V-FITC可以进入到细胞浆内,与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合,从而也使坏死细胞呈现绿色荧光

 

注意事项:

 如果有细菌或真菌污染,会严重影响检测效果。

 染色后宜尽快检测,时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

 如果细胞收集过程中使用了胰酶,需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC,最终导致染色失败。

 荧光物质均易发生淬灭,在进行荧光观察时,尽量缩短观察时间,同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

 

实验步骤:

两块6孔板,细胞密度:1X105/孔(加样时30%-50%,收细胞时70%-80%),细胞计数种板,种板时加2 mL培养基。

 

  1. 加材料组作用4h,光照,孵育时间(>10h)。
  2. 单染组(PI/FITC)中加入30 μL H2O2  (由市售30% H2O2 10 μL加到 1mL PBS中配制),处理1-2 h。
  3. 1h之后先处理①号板-实验组。
  4. (所有孔一起消化处理)将培养基取出于对应4 mL EP管中,加1 mL PBS, 轻轻洗一次,也收集到4 mL EP管中,再加入 1mL 无EDTA胰酶消化,去掉胰酶,加1mL DMEM(+)终止消化,吹打均匀,将细胞收集到4 mL EP管中,再用1mL PBS洗残留细胞,收集到4 mL EP管中。
  5. 处理②号板,先处理FITC/PI单染H2O2处理组,不用加胰酶直接吹下来。
  6. Control组(不染)(消化之后先不离心)、FITC/PI双染组,去掉上清,PBS洗一次,丢弃上清,加无EDTA胰酶,加1mL DMEM(+) 吹散, 消化不要过度,可残留一部分细胞,保证消化下来的细胞都是好的。
  7. 全部EP管离心1500 rpm, 5 min, 去掉上清(一定要去除干净,防止培养基对染色的干扰),加400 μL 1X Binding Buffer分散,过滤细胞。开机。加入5 μL Annexin V-FITC,轻轻混匀于冰上避光孵育10 min之后,加入10 μL PI后轻轻混匀于冰上避光孵育5 min,测试。
  • 整个操作过程尽量要快(<1 h)

 

无EDTA胰酶配制 (0.25%):

胰蛋白酶0.125g

PBS 50 mL

0.22 μm滤头过滤,分装到1.5 mL EP管,每个1 mL, 保存到-20℃。

 

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