【实验技术笔记】细胞表型检测之细胞凋亡（Hoechst染色 + PI染色 + TUNEL 染色 + Annexin V-PI 双染）

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已于 2022-06-24 14:03:00 修改

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分类专栏：分子生物学文章标签：学习

于 2022-06-24 14:02:33 首次发布

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本文详细介绍了细胞凋亡的检测方法，包括Hoechst染色、PI染色、TUNEL染色和Annexin V-PI双染。通过这些染色技术，可以观察细胞核形态变化、细胞膜通透性以及DNA断裂情况，从而判断细胞是否处于凋亡状态。实验过程涉及细胞固定、染色、荧光显微镜或流式细胞仪检测等步骤，对于细胞凋亡的研究具有重要意义。

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1. 细胞凋亡

细胞要增殖分裂出新细胞需要经过完整的细胞周期，细胞周期中有 2 个关键的 check-point 细胞周期检验点：
△ G1/S check-point：调控细胞从静止状态进入 DNA 合成期，防止有损伤或突变的细胞进入 S 期，并启动相应的信号通路进行损伤修复。
△ G2/M check-point：是决定细胞分裂的控制点。如果能够通过这个检查点，细胞内的染色体就能收缩，开始有丝分裂；如果不能通过，细胞就会暂停，启动 DNA 的损伤修复机制。如果 DNA 损伤修复机制仍然不能修复，细胞就会进入程序化的细胞凋亡路径。

细胞凋亡（Apoptosis）的过程

细胞凋亡：是细胞主动的，有步骤的死亡过程，不涉及炎症。
细胞坏死：被动的，无序的死亡过程。
在压力刺激下（紫外线、氧化剂、烷化剂、药物等），细胞的基因组 DNA 可能会发生损伤，如果损伤能被修复，就能继续行使功能；如果损伤不能被修复，细胞就无法进入正常的细胞周期，就会主动进入细胞凋亡过程。

在细胞凋亡时，细胞核会发生变形、浓缩、碎裂，因此我们可以通过检测细胞核的形态来判断细胞是否凋亡，比如用 Hoechst 染色或 DAPI 染色。
细胞膜也会发生变化，部分膜会包裹细胞的内容物形成凋亡小体，因此我们可以通过电镜观察有没有凋亡小体来判断细胞是不是正在凋亡。
胞膜还会发生的一个变化是破损外翻，这样我们就可以用一些标记细胞膜内侧的染料来检测细胞膜是否外翻，配合检测细胞核内物质的染料进行双染，判断细胞凋亡的程度，比如 Annexin-V/PI 双染。
△ Annexin-V 是细胞膜内侧独有的磷脂酰丝氨酸的特异性染料，对磷脂酰丝氨酸有高度亲和性。
△ PI 不能通过活细胞膜，细胞凋亡时，细胞核内的核酸能被 PI 染色，所以能被 PI 染色标记的细胞就是凋亡得厉害的细胞。
细胞凋亡时还有个显著特征是基因组 DNA 的片段化，可以抽提基因组 DNA 去跑电泳观察是否有规律排列的 DNA ladder。
△ 基因组 DNA 的片段化：细胞凋亡时，核酸内切酶被激活，在核小体与核小体之间切割，将 DNA 切割成大小为 200bp 的整数倍的片段。
DNA 断裂时，DNA 的 3’端断裂口会出现游离的 3’-OH，可使用 TUNNEL 法检测细胞凋亡。（利用脱氧核糖核酸末端转移酶将脱氧核糖核酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素标记到 DNA 3’端，正常细胞几乎没有 DNA 断裂，不会被标记，通过观察荧光信号或 DAB 显色后是否有棕黄色的阳性信号，判断细胞是否发生凋亡。）
还有一个利用 DNA 片段化这一特征检测细胞凋亡的方法是 PI 染色。PI 可以染基因组 DNA，细胞凋亡时形成的短片段 DNA 被 PI 染色后，比长片段 DNA 颜色浅，从而区分正常细胞和凋亡细胞。
细胞凋亡是基因严格控制的过程，涉及一些列基因的激活、表达、调控等，这些基因在种属之间是保守的，如 bcl-2 家族、Caspase 家族、癌基因 c-myc、抑癌基因 p53 等，可通过检测相关通路和分子 marker 检测细胞凋亡。

细胞凋亡不仅会发生在细胞出现损伤而无法修复的时候，也会发生在像发育这种正常的生理过程中。它既可以清除那些坏掉的细胞，也可以清除那些虽然没坏，但是机体已经不需要的细胞。

2. 检测细胞凋亡：Hoechst 染色

Hoechst 染色检测细胞凋亡的原理

Hoechst 是一种蓝色荧光染料。
有 3 种类似物，分别是 Hoechst 33258，Hoechst 33342 和 Hoechst 34580。
其中 Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 最常用，两者具有相同的激发光谱和发射光谱范围。Hoechst 33342 渗透性更好，更推荐。
Hoechst 能穿过细胞膜与 DNA 双螺旋的小沟结合，尤其是富含 AT 的序列。
DAPI 也是染细胞核的蓝色染料，如果是染固定细胞，两者都可以，如果是染活细胞，建议用 Hoechst，因为 Hoechst 对细胞的毒性比 DAPI 小。
Hoechst 33342 和 Hoechst 33258 都能用 350nm 的紫外光激发，最大发射光 461nm（蓝色）。
正常细胞 基因组 DNA 分布均匀，Hoechst 染色后是比较均匀的蓝色，细胞核是圆圆的。
分裂旺盛的细胞 具有比较大的核仁，在核仁的位置染不上 Hoechst，会出现黑色的空洞，核的边缘比较清晰，且形状比较规则的。
凋亡细胞 由于核固缩、变形、碎裂，Hoechst 染色的核的形状变成月牙状或碎裂成几块，呈现出来的蓝色发白发亮。
适用于检测培养的细胞和组织样本。