引物设计软件primer_荧光定量PCR引物探针设计原则

从这篇文章开始我们谈一下荧光定量PCR引物探针设计原则和技巧。本人水平有限，如果有错误，烦请大家指出。

我们先来看一下引物和探针设计的通用原则。

Taqman荧光PCR探针和引物设计指南（PrimerExpress 3.0, ABI）

这个表格基本上把引物探针设计原则都说的很清楚了，只要按照上面的原则一般都能设计出比较好的引物探针。

网上应该可以找到很多关于引物设计的原则和注意事项，然而并没有什么用。引物探针基本上都是软件设计的，比如PP5、PrimerExpress、Beacon Designer等，我们不需要管那么多原则。如果软件不能设计出比较好的引物探针，那剩下的就是我们的体力活了，一条一条引物探针进行筛选。引物探针设计最主要的不是设计，而是引物探针的评估。引物探针评估的时候反而这些原则才有用场。所以大家不要用反了顺序。（这段话是经验之谈，仅供参考）

首先blast是否特异，然后评估Tm值确定试验退火温度，然后评估二聚体结构，再评估引物探针发夹结构。这些结构的存在都会影响PCR反应效率。

需要提醒的一点，软件设计出来非常好的引物探针，试验结果可能不会好，但是大部分时候都非常可靠。还有就是每个软件Tm值、二聚体、发夹结构计算方式不一样，得到的结果也会有差异啊。