双荧光素酶实验的操作流程

转化及质粒提取过程

使用DH5α大肠杆菌感受态细胞进行转化，将公司送回的质粒干粉先于离心机顺式离心，然后加入适量的水进行溶解（因为质粒量很多也很好转染，这步加入多少的水对实验的结果都没有影响），然后再次顺式离心获得质粒溶液。购买的感受态细胞一般为100微升/支，取其中的三分之一作为质粒转化的量就足够了，即一管做三个转化。感受态细胞保存在-80℃的冰箱中，取出时必须置于冰箱进行融化。加入之前的质粒溶液3微升（不超过感受态细胞的十分之一），不允许吸打溶液，包括之前感受态细胞的分装也是。冰上孵育30-60 min，加入800-900微升不带有抗生素的培养基，摇床上复苏45-60 min。将复苏完的菌液加入到带有19 mL含抗生素的培养基的50 mL离心管中，松开盖子在37℃的摇床上培养16-24小时，随后按照质粒提取的试剂盒进行质粒提取（详细操作见tiange质粒小提中量试剂盒使用说明），20ｍＬ的菌液分为两支管子于过吸附柱那步时加入到同一支管子中，最后洗脱体积为40微升。
获得的质粒于六楼测定质粒浓度，先用纯水清洗和擦拭检测器，滴上试剂盒中的EB溶液作为blank，测定完成后再次加入EB　re-blank，直至曲线基本为一条平整的线，然后加入样品进行测定，记录样品的浓度。

细胞铺板

从传代过程中分出细胞先提前接种到24孔板上，用于后续过程中的细胞转染，根据lipo 3000说明书上的要求24孔板生长到70%-90%较为合适，细胞数量在0.5-2×105左右，可以使用constar的细胞计数器进行细胞计数来确定细胞悬液中的细胞数目。HaCaT细胞铺板过程中我使用一瓶T25培养瓶细胞的1/