NC：经颅聚焦超声介导的人类深部皮质神经化学和功能连接的变化

摘要：低强度经颅超声刺激(TUS)是一种新兴的非侵入性脑功能局部调节技术。人类TUS神经调节的机制和神经化学底物以及它们与兴奋和抑制的关系仍然知之甚少。在24名健康对照中，我们分别刺激了两个皮层深部区域，并研究了theta-burst TUS对抑制性神经递质γ氨基丁酸(GABA)和功能连接的影响，该方案显示可以增加皮质脊髓兴奋性。我们发现，在人类的theta-burst TUS选择性地降低GABA水平的后扣带，但不是背前扣带皮层。在TUS之后，两个区域的功能连通性都有所增加。我们的研究结果表明，TUS通过减少GABA能抑制来改变整体兴奋性，并且TUS介导的神经可塑性的变化在刺激后至少持续50分钟。TUS对后扣带和前扣带作用的差异可能表明TUS作用的状态或位置依赖性-这两种机制越来越被认为影响大脑对神经调节的反应。

1. 引言

低强度聚焦经颅超声刺激(TUS)是一种非侵入性神经调节技术，从基础神经科学研究到神经和精神疾病的治疗应用，都显示出了广泛的应用前景。与其他非侵入性神经调节技术，如经颅磁刺激(TMS)和经颅直流电刺激(tDCS)相比，TUS可以靶向皮质和脑深部区域，具有非常高的空间特异性。根据所使用的超声模式，TUS的神经调节作用可以限制在刺激期间或刺激后立即(“在线”效应)，也可以持续几次刺激后几分钟到几小时(“离线”效应)。离线TUS效应特别有趣，因为它们可能反映了长期增强/抑郁样神经可塑性，比短暂的神经元适应效应持续时间更长，有可能用于调节大脑区域或网络的异常活动，用于治疗应用。据认为，TUS主要是通过超声波在目标位置通过细胞时的机械相互作用诱导神经调节的。然而，其转化为兴奋性或抑制性神经调节的机制及其对大规模人脑连接的影响尚不清楚。

离线TUS与磁共振成像(MRI)的高空间分辨率相结合，可以在局部水平(单个目标区域)和整个大脑(包括脑深部)的网络水平上测量TUS效应。之前对猕猴和人类的研究已经使用功能性磁共振成像(fMRI)和动脉自旋标记来显示由于TUS导致的脑活动和灌注的大规模变化。在猕猴中，皮层深部和皮层下区域的TUS显示出基于任务的fMRF和行为以及静息状态fMRI (rsfMRI)目标区域连接谱的变化。在人类中，TUS已被证明影响rsfMRI连通性和区域灌注的变化。利用磁共振波谱技术(MRS)，可以量化体内主要抑制性神经递质γ -氨基丁酸(GABA)和主要兴奋性神经递质谷氨酸的水平，从而深入了解tus诱导的神经可塑性的GABA能和谷氨酸能机制。伽马氨基丁酸的MRS测量无法区分细胞内或细胞外的伽马氨基丁酸，但被认为代表了强张性抑制和该区域的整体抑制性“音调”，而不是阶段性或突触性抑制2。在大鼠中，TUS已被证明可以降低细胞外GABA，但在干预后120分钟内谷氨酸水平没有变化。迄今为止，MRS尚未被用于探索人类TUS神经调节的神经化学基础。在这里，我们研究了TUS是否能在休息时诱导两个具有明确和可分离连接谱的深部皮层区域的离线变化:背前扣带皮层(dACC)，突出网络的一部分5和后扣带皮层(PCC)，默认模式网络的主要枢纽，在清醒休息时最活跃。这些网络中的异常功能连接与几种神经和精神疾病有关，使这些区域成为治疗性TUS应用的潜在靶点。

利用MRS和rsfMRI，我们在单独的会话中刺激每个区域，并将效果与假刺激进行比较。我们发现，刺激后20-30分钟，只在PCC中选择性地减少GABA水平。我们还发现，在TUS后，两个区域的功能连通性都有所增加，rsfMRI连通性的最大增加发生在较晚的时间点(TUS后-46分钟)，而不是较早的时间点(TUS后-13分钟)。此外，PCC的刺激也增加了dACC的功能连通性，反之则没有。重要的是，我们还表明，通过声学测量和模拟，我们能够有效和安全地针对我们研究中所有个体的深层皮层区域，这在美国对深层大脑区域的研究中经常被忽视。我们的研究结果表明，体内GABA的变化是由TUS调节的，功能连接的变化随着时间的推移而变化，并在刺激后持续至少50分钟。PCC和dACC刺激之间的不同发现表明，TUS可能存在状态或位置依赖性，这对未来人类TUS研究的设计和发展具有重要意义。

图1 研究设计。参与者(n=24)首先参加了一个只有MRI的实验，在那里他们进行了结构MRI扫描，并被分配到六个随机分组之一，这决定了经颅超声刺激(TUS)条件的顺序(在参与者之间平衡)。结构MRI用于计划和定位随后的三个研究阶段的TUS，包括假TUS或立即将TUS应用于左扣带前背皮层(dACC)或左扣带后皮层(PCC)然后进行一系列核磁共振扫描。扫描包括5分钟的静息状态fMRI运行，。每个参与者每天大约在同一时间进行，间隔至少一周。图中显示的是所有参与者的平均时间。PD脉冲持续时间，PRI脉冲重复间隔。

2. 结果

在这项对24名健康成人的预注册研究中，我们通过比较左ACC、左PCC、左ACC、左PCC、左ACC、左PCC、左ACC、左PCC、或假TUS(见图1中的研究设计)。在第1阶段(仅MRI阶段)之后和每个TUS目标位置的三次TUS和MRI阶段之前，对一部分参与者(n=4)进行了声学模拟，以确保我们保持在TUS的安全指南内。在研究结束时，对其余参与者进行了声学模拟。所有参与者都完成了三次TUS和MRI会话，其中TUS应用于左侧dACC或左侧PCC，或假TUS(无刺激)，然后进行MRI扫描。

我们首先描述了声学模拟的结果，并展示了每个目标区域的模拟经颅压力场。接下来，我们报道了TUS介导的左侧dACC和左侧PCC中GABA和谷氨酸的变化，随后是TUS介导的左侧dACC和左侧PCC功能连通性的变化。最后，我们描述了探索性分析光谱和功能连接变化之间的关联，以及与模拟经颅声学测量的个体间差异相关的变化。

2.1 用自由场模拟表征超声场

我们模拟了换能器在自由场中产生的两个三维声压分布:60 mm(图2a)和69 mm(图2b)，分别代表了左侧dACC和左侧PCC区域的个体平均焦深度。目标空间峰值脉冲平均强度(sppA)为33.8 W/cm?经颅传输前，TUS焦点处最大压力为1.01 MPa，力学指数(MI)为1.4，空间-峰值-时间-平均强度(IsPTA)为3380 mW/cm。模拟结果表明，沿光束轨迹的焦点区域长度在60 mm处比69 mm处短(沿轨迹半最大时的全宽度分别为32.1mm和39.4 mm)。梁横向截面的FWHM为在60mm处为4.5 mm，在69mm处为5.0 mm，表明在更深的焦深处TUS焦稍宽。

图2 自由场声学模拟。声压的轴向(z轴)和横向(x轴和y轴)横截面，以及压力剖面图，显示了两个焦点深度。在压力分布图中虚线表示超声波束半最大值全宽度(FWHM)的上下边界。在60 mm处，这相当于沿梁的轴向平面32.1 mm，横向4.5 mm。在69 mm时，FWHM为沿轴向和侧向分别为39.4 mm和5.0 mm。

2.2 用自由场模拟表征超声场

经颅声学模拟我们通过来自T1加权MR图像的伪计算机断层扫描(CT)图像估计每个参与者的头骨(图3a)。经颅模拟显示，强度轮廓保持椭圆形，与自由场模拟的大小和形状相似，轨迹是线性的，并保持与换能器表面近似垂直，这使我们能够可靠地瞄准所有参与者的dACC和PCC(图3b)。

经颅和MI均低于美国食品和药物管理局(FDA)对这两个地区的推荐限值。我们模拟了衰减最大的两个参与者的体温上升。在换能器下方的颅骨中发现了最大温升(1.48°C和1.88°C)，两个人的温升都不超过2°C。表1总结了两个区域焦点处的声学特性。dACC和PCC在焦点处显示出相似的最大强度和压力，然而，dACC模拟的焦点体积(-6dB体积，或FWHM压力)以及与MRS体素重叠的体积比PCC模拟的小。这可能是因为在更深的焦点深度处看到的超声束的延伸(图2)。我们的模拟显示，在每个会话期间，椭圆TUS焦点在很大程度上与2×2×2cm' MRS体素重叠(图3c)，这表明在各个会话中手动放置MRS体素的一致性，并且我们能够在同一区域进行刺激和测量。我们还发现焦块体积与IsppA呈负相关，焦块体积越大，IsppA越低。

图3 代表性个体的经颅声学模拟。a: 伪CT(右)源自T1加权MRI(左)，用于估计颅骨声学特性。b: 覆盖在T1加权MRI上的模拟超声压力场显示可靠的前扣带皮层背侧靶向(dACC)和后扣带皮层(PCC)。c: 代表个体模拟经颅超声刺激(TUS)的局压体。

与TUS相关的副作用

表1经颅超声刺激(TUS)焦点处的模拟声学特性

2.3 与TUS相关的副作用

每次学习结束后的第二天，参与者都会收到一份带有开放式问题的TUS症状问卷:“在学习期间或之后，你是否经历过任何不愉快或痛苦的事情?”三名参与者报告说，他们在瑜伽课程后比平时更疲劳。其中一名参与者报告说，在他们的dACC TUS实验后的下午有轻微的头痛，在一天内解决，在PCC TUS实验后没有头痛。另一名参与者报告说，假手术后持续头痛和颈部疼痛，他们认为这是由于在MRI中必须保持静止，而不是由于TUS手术。一位参与者报告说，在PCC TUS会议期间，在传感器放置的一英寸以下，有一种凉爽的感觉(“好像我的头发是湿的”)。

2.4 PCC的TUS选择性地降低PCC中的GABA

我们发现，应用于PCC区域的TUS降低了PCC体素中的GABA，但在dACC中没有降低(图4b)。在PCC体素中，以年龄、性别、模拟原位IsppA和TUS焦体积与MRS体素重叠为协变量的一般线性模型(GLM)显示出会话的显著主效应，在dACC TUS后，在dACC体素中测量的GABA+/水在两组之间没有显著差异(图4a)，在两组体素谷氨酸+谷氨酰胺复合在两组之间没有显著差异。这些结果显示，PCC中GABA在PCC TUS后局部减少，表明GABA仅在超声处理的区域选择性减少。

图4 经颅超声刺激(TUS)后GABA+/water的变化。在每个TUS和假手术后，n=24个体的GABA+/水浓度显示在a前扣带背皮层(dACC)体素和b后扣带皮层(PCC)体素上。灰线将来自同一个人的测量值连接在一起。粗体粉色线表示每次会话的平均值和平均值的标准误差。

我们发现，与假手术相比，dACC和PCC的TUS均在dACC和PCC的TUS后，与dACC的功能连通性都有所增加(所有比较聚类均以p< 0.05校正)。与假手术相比，在dACC注射后约13分钟，楔前叶皮质的dACC功能连通性增加。在dACC TUS约46分钟后，与假手术相比，dACC的功能连通性在更广泛的区域网络中增加，包括楔前叶和脑碱内皮层、双侧丘脑、右侧壳核、左侧海马旁回和辅助运动皮层，包括双侧中央前和后回(图5a)。与假手术相比，在PCC TUS 13分钟后，双侧中央前回和右侧顶叶上叶的dACC功能连通性也有所增加(补充图2)，这可能表明PCC神经调节可以影响目标区域以外的大脑连通性。与假手术相比，PCC术后46分钟与dACC种子的连通性没有显著差异。与假手术相比，PCC的功能连通性仅在TUS后增加。换句话说，PCC的网络轮廓不受应用于另一个区域(这里是dACC)的TUS的影响。与假手术相比，PCC TUS后13分钟双侧壳核的功能连通性增加，46分钟中央前回、双侧听觉皮层和左颞极的功能连通性增加(图5b)。

图5 经颅超声刺激(TUS)后功能连通性变化:基于种子的连通性分析。与假手术相比，全脑图显示，与前扣带背皮层(dACC)和后扣带皮层(PCC)相比，前者在TUS作用于dACC后，后者在TUS作用于PCC后，功能连通性增加。对于每个种子区域，进行全脑质量单变量GLM，并显示来自两个单侧对比的Z统计图像(阈值使用Z>2.3确定的聚类和FWER校正的聚类显著性阈值p=0.05)的统计显著聚类。橙色的簇表示在TUS后-13分钟具有显著更高功能连通性的区域，黄色的簇表示与两次假手术的平均值相比，在TUS后46分钟显示出明显更高的功能连通性区域。对于每个种子区域，蜘蛛图显示了在每次运行期间从显示连接性显著增加的区域和三个控制区域采样的功能连通性(来自GLM的参数估计):(i)未被TUS靶向的区域，(ii)已知与种子区域高度连接的区域，以及(iii)背外侧前额叶皮层。误差条表示均值的标准误差。

2.5 TUS增加了与目标区域相关的静息状态网络的功能连通性

为了研究静息状态下TUS对全脑网络的影响，我们确定了两种明确的静息状态功能连接。使用独立组件分析(ICA)与我们的TUS目标相关联的网络，以dACC为主要组件的突出网络，以及以PCC为主要枢纽的默认模式网络。通过双重回归获得每个网络的受试者特定图谱，并将每个TUS会话的每次运行与模拟运行的平均值进行比较。我们发现在dACC的TUS后显著性网络的连通性增加(图6a)，而在PCC的TUS后默认模式网络的连通性与sham相比增加(图6b)。值得注意的是，这些变化只在rsfMRI的后期运行中看到(即在TUS后约46分钟)，这与基于种子的连通性分析观察到的TUS后更大的功能连通性变化一致。当TUS应用于其他区域时，显著性和默认模式网络的连通性没有显著变化。

2.6 GABA与功能连接改变之间无关联

我们发现GABA的变化与功能连接的变化之间没有显著的相关性，这些变化与声学模拟得到的焦点体积或强度之间没有相关性。

图6 经颅超声刺激TUS后功能连通性变化:独立成分分析。在实验期间，通过fMRI运行的独立成分分析确定的a显著网络和b默认模式网络的组平均图显示在每个子面板的顶部。每个子面板的中间行显示组平均值在TUS后46分钟(即fMRI运行2)，通过对偶回归获得fMRI运行期间的网络。最下面一行显示了运行2次TUS会话和模拟会话平均值之间网络连通性显著差异的空间图。

3. 讨论

在这里，我们显示了在80秒的离线模式的TUS脑电刺激后，两个皮层深层区域的神经化学和功能连接的变化。我们发现PCC在不同的MR模式下发生了一致而强劲的变化:MRS测量的GABA减少，rsfMRI与PCC目标以及默认模式网络的功能连通性增加。这些变化表明，theta-burst TUS可以在TUS后至少50分钟内暂时降低人类皮层深部区的皮质抑制。我们的发现补充了现有的证据，即theta-burst TUS增加了人类运动皮层的皮质-脊髓兴奋性，并且还代表了与theta-burst TUS在皮层深部区域相关的神经化学和功能连接变化的证据。相对于刺激持续时间，兴奋性变化的时间尺度在TUS后至少持续50分钟，这表明可逆神经可塑性的诱导，可能与神经元的长期增强/抑制有关。

在对PCC施加theta-burst TUS后，PCC体素中GABA水平显著下降，这表明目标区域内GABA的局部减少。这表明，在人类中，TUS介导的GABA减少，并补充了超声后大鼠细胞外GABA减少的发现。在其他类型的刺激后，包括TMS和tDCS，也有局部GABA减少的报道。在人类中，使用重复经颅磁刺激和MRS的研究显示，经颅磁刺激靶2021和与靶相连的网络区域的GABA水平发生了变化。

PCC的功能连通性在PCC的全脑区域网络中增加，dACC的功能连通性也在dACC的TUS后增加。在基于种子和基于网络的分析中，早期和晚期rsfMRI运行(分别约为tus后13分钟和46分钟)之间的连通性增加模式存在差异，较大的区域网络在后期rsfMRI运行中显示出增加的连通性。这反映在基于网络的ICA中，默认模式网络和显著性网络在其相关区域的TUS之后都显示出明显的变化，仅在rsfMRI运行的后期而不是早期运行。

PCC和dACC皮层形态和神经元组成的内在差异也可能导致神经调节作用的差异。dACC是一个复杂的区域，70%的个体在至少一个半球上除了有扣带沟外，还存在额外的扣带沟，即旁扣带沟。这可能会导致dACC功能的异质性，以及对神经刺激的异质反应。也有可能刺激在不同的神经元群中表现出不同的神经调节作用。来自人类蛋白质图谱的转录组学数据表明，这两个区域之间存在潜在的组织组成差异，特别是几个离子通道存在的差异。例如，t型Ca2通道被认为对超声敏感，与dACC相比，相应的蛋白质编码基因可能在PCC中优先表达。

我们发现Glx(谷氨酰胺+谷氨酸复合物)的浓度没有变化。对此可能有几种解释。首先，MEGA-PRESS是一个GABA编辑序列，并没有优化测量Glx。Glx可以从非共振MEGA-PRESS光谱中量化，但这些测量在不同大脑区域的可靠性尚不清楚。一项研究发现，在背外侧额叶皮层中，PRESS和off - resonance MEGA-PRESS Glx估计高度相关。然而，另一项专门针对dACC的研究发现，感觉运动皮层的PRESS和非共振MEGA-PRESS之间的一致性比dACC更好，尽管这两个区域与单独获得的PRESS谱的一致性较差。未来的研究可以使用其他序列来量化Glx或在更高的MR场强下获得光谱，以便可以分别测量谷氨酰胺和谷氨酸信号。

我们的声学模拟显示了不同目标深度下的压力分布和焦场大小的差异，这是针对深部皮层区域的重要考虑因素，并突出了声学模拟在美国的重要性。我们观察到个体间在TUS的焦体积和强方面的差异。这种个体间的差异可能是由于几个因素造成的，包括由于颅骨引起的声压散射和相对于个体颅骨的TUS定位。虽然我们没有发现病灶体积或强度的可变性与GABA或功能连通性的变化量之间的任何关联，但在更难定位的区域(例如，颅骨不完全垂直于光束的轨迹，或其组成不均匀)，这可能是不同的，值得在分析结果时考虑或考虑。

目前，TUS研究界对确定兴奋性或抑制性TUS协议很感兴趣。我们的研究结果通过解释theta-burst TUS如何在两个深部皮层靶点及其相关的全脑区域网络中诱导神经可塑性来帮助阐明这一过程，并表明这些变化可能是状态依赖性的。这对理解和设计基础研究及其临床转化具有根本意义。

4. 方法

该研究已于2022年3月10日在开放科学框架上预注册。与预注册协议的唯一偏差是我们根据水听器的测量值设置了自由场ISPPA。

4.1 被试

24名健康志愿者(女性14名)，年龄22 ~ 53岁(平均=33.8,s.d±9.7)。参与者报告目前没有神经或精神疾病的诊断，并且在研究期间没有服用任何已知会影响大脑兴奋性的药物。特别是考虑到TUS和MRI的安全性，我们在研究时排除了以下参与者:1)怀孕(自我报告)，2)正在使用精神活性药物，3)有任何核磁共振禁忌，4)目前或以前诊断为任何神经系统疾病，5)目前或以前诊断为精神疾病(包括患有严重精神疾病，但不包括抑郁/焦虑史)，6)有一级亲属患有癫痫，7)经历极端情绪波动，或8)目前正在使用处方药或非处方药(包括作用于中枢神经系统的药物、促惊厥药物、降低癫痫发作阈值的药物(或药物组合)或戒断导致癫痫发作阈值降低的药物(即抗惊厥药物戒断)，除非这些药物不影响研究程序或危害安全性。该研究得到了普利茅斯大学卫生学院工作人员研究伦理和诚信委员会的批准。在完整解释实验过程后，获得所有参与者的书面知情同意。参与者每完成一节课可获得30英镑的补偿，每节课的差旅费最高可达10英镑。所有的研究都在英国普利茅斯的大脑研究和成像中心进行。

4.2 实验设计

图1总结了研究设计和程序。所有参与者在每天的同一时间(±30分钟)至少间隔一周完成三次单独的TUS和MRI会话，以控制昼夜节律对GABA波动的影响。在每个疗程中，他们分别在左dACC、左PCC或假TUS上进行TUS，然后进行一系列MRI扫描。在假的TUS过程中，没有任何刺激，传感器被放置在中扣带皮层上。三个会话(dACC TUS, PCC TUS，或假TUS)的顺序在受试者之间是平衡的。对于那些被指定在他们的第一次会话中进行TUS的参与者，我们在他们的第一次TUS和MRI会话之前获得了高分辨率的t1加权MR图像。

4.3 超声波刺激

我们使用了NeuroFUS TPO和CTX-500-4换能器(Brainbox Ltd, Cardiff, UK)。这包括一个四单元超声换能器(直径64毫米)，中心频率为500千赫。我们使用theta-burst TUS协议，其参数如下:脉冲持续时间=20 ms，脉冲重复间隔=200 ms，总持续时间=80 s，总共400个脉冲。目标自由场空间峰值脉冲平均强度保持在33.8 W/cm2不变。我们进行了经颅声学模拟(见“声学模拟”部分)，以确保我们仍然低于FDA超声诊断指经颅传播。此外，在我们所有的热模拟中，我们确保整个TUS持续时间的80°c的最高温升不超过2C。我们通过在预定目标上分开任何头发并使用超声波透射凝胶来准备每个参与者的头部。我们将超声凝胶涂在换能器上，使用凝胶垫，并尽可能确保换能器面部和受试者头部之间没有气泡。使用Brainsight软件v进行神经导航2.4.1对每位参与者进行解剖性tl加权MRI扫描。根据神经导航目标，调整每个参与者和大脑区域的焦点深度。在TUS期间，我们用软件对换能器坐标进行采样，并注意到与预期焦点的任何偏差。利用换能器和目标的位置进行声学仿真。每次超声检查后，参与者被要求通过第二天完成的开放式TUS症状问卷报告他们认为与TUS相关的任何症状。假TUS以与真TUS相同的方式传递，只是换能器的电源被关闭。为了控制听觉效果，我们通过骨传导耳机播放了模仿verum TUS脉冲重复和持续时间的声音。我们设计的波形与TUS协议产生的超声脉冲(频率，脉冲重复频率和脉冲持续时间)相匹配。我们调整了采样率来改变声音的音高，并要求五名经历过TUs协议的实验室成员投票选出最符合TUs的声音，并在假条件下播放。在所有的会话中，耳机都被放置在参与者的头部太阳穴后2厘米处，并且声音只在假会话中播放，以便参与者在verum TUS条件下不会听到两种不同的声音(即，来自TUS协议的实际声音和通过耳机播放的音频)。当他们完成所有三个阶段后，参与者被问及他们是否能够区分虚假和真实。

4.3 超声和MRS的目标位置

根据与蒙特利尔神经学研究所坐标空间的dACC和PCC的初始共同注册，确定了TUS的左dACC和左PCC靶点。然后根据每个人的t1加权MRI上的解剖标志进行调整。dACC靶点与膝后部和胼胝体体的最上端对齐，以扣带回的一块灰质为中心。PCC靶与胼胝体脾部中部对齐，大致与扣带沟上升支对齐，并以扣带沟下方的一块灰质为中心。在TUS会话中以目标为中心的体素中获取MRS，以确保TUS焦点和MRS获取之间的重叠。在两个个体中放置体素的示例如图3所示。

4.4 声学测量与模拟

我们使用校准的0.4 mm Onda水听器在定制的水箱中测量了NeuroFUS换能器的输出。水箱(玻璃鱼缸;长=80 cm，宽=35 cm)，在23.1°C下填充去离子水(水深=27 cm)。NeuroFUS系统的脉冲持续时间为0.06 ms，脉冲重复间隔为2ms，最大输出功率为2瓦。线扫描沿光束轴在聚焦中心的80毫米范围内进行1mm步长，沿超声束穿过聚焦的横向横截面在30毫米范围内进行0.5 mm步长。我们测量了两个焦点深度设置(60 mm和69mm)的轴向和侧向压力分布，并基于测量的自由场强度进行声学模拟。我们使用MATLAB (R2020b, MathWorks, Inc.)中的k-Wave Toolbox37(版本1.4)进行模拟，并根据NeuroFUS换能器的物理特性和TPO单元上报告的相位对换能器进行建模。我们首先在水中进行声学模拟，以表征经颅衰减前目标IsppA为33.8 W/cm2的超声束。由于dACC和PCC在皮层的深度不同，我们模拟了60 mm和69 mm的超声束焦深度。

接下来，我们对研究中每个参与者的dACC和PCC进行了经颅模拟。我们使用深度学习方法从参与者的t1加权MRI衍生的伪ct中估计每个参与者的头骨3839。通过阈值为300 HU，箝位值在2000 HU以上的伪ct图像获得颅骨。伪ct胡强度用密度、声速和吸收系数方程线性映射到声学特性，如参考文献所述。40、41。我们将模拟网格大小设置为以换能器和焦点之间的中点为中心的256 × 256 × 256矩阵，网格间距为0.5毫米(即在500千赫时每个波长6个点)。

4.5 光谱数据分析

在Gannet3中进行MRS处理和分析处理步骤包括3hz线拓宽，通过频谱配准校正频率和相位误差，抑制异常值，时间平均和涡流校正。对编辑后的差谱进行建模，以量化相对于水的3.0 ppm GABA+和3.75 ppm Glx信号。使用SPM125对t1加权MR图像进行分割，以获得MR体素内的组织校正测量值。目视检查MRS光谱的光谱伪影，包括脂质污染，减法误差和非恒定基线。如果数据在以下质量指标上是异常值，我们将其排除:FWHM、GABA+信噪比(SNR)、线宽和模型拟合误差。在伪会话期间从dACC和PCC体素获得的示例光谱如图3所示。对于每个体素，使用GLM以年龄、性别、模拟原位IsPpA和模拟MRS体素内的us病灶体积作为协变量来评估TUS和假体素之间GABA+/water和Glx/water的变化(主效应和事后检验的方差分析，使用Holm校正进行多重比较，认为p<0.05具有统计学意义)。根据可能影响体素内GABA水平的因素选择协变量。采用JAMOVI版本进行统计分析2.0.0。缺失或排除的数据在模型中被视为nan。

4.6 功能性MR数据分析:基于种子的连通性

Fmri数据使用FSL的一部分FEAT (FMRI专家分析工具)Version 6.00进行预处理和分析。预处理包括运动校正、BO场非均匀性校正、脑区提取、空间平滑(5 mm FWHM)和高通滤波(0.01 Hz)。rsfMRI数据通过对受试者高分辨率t1加权MRI的线性变换和对MNI模板的非线性变换，共同注册到MNI标准空间。使用fslmotionoutliers工具识别运动异常值，并将其与来自白质和脑脊液的平均信号以及来自运动校正步骤的六个运动参数一起纳入干扰协变量。对于每个受试者和每个会话，以从dACC和PCC声学模拟中获得的受试者特定的TUS焦点体积作为种子，进行基于种子的连通性分析。为了创建特定于受试者的TUS种子，首先从模拟压力场中前25%的最大压力强度创建二进制掩模。然后将这个二进制体积扩大两个体素，得到dACC的平均种子体积为805±162 mm3, PCC的平均种子体积为1003+178 mm(作为参考，用于基于种子的功能连接分析的典型6mm半径球形种子体积为905 mm)。

首先在受试者水平上将dACC和PCC种子的功能连通性结合起来，用固定效应模型将每次TUS会话和运行与假运行的平均值进行比较。采用混合效应模型(FLAME1+2)，以年龄和性别为协变量进行自动异常值检测，对每个种子的受试者进行比较。全脑Z统计图的阈值采用Z>2.3 (p-0.05)确定的聚类，家庭误差校正的聚类显著性阈值为p=0.05。每个TUS会话与假手术条件下相应运行的比较(即跑1次TUS vs跑1次假手术，跑2次TUS vs跑2次假手术)产生的结果在空间范围上相似，但没有统计学意义(补充图4)。由于在假手术条件下两次跑步之间没有统计学意义上的差异，我们将假手术结合起来，以增加fMRI信噪比和我们检测活动TUS和假手术条件之间差异的能力。

4.7 功能MR数据分析:静息状态网络连通性

我们研究了TUS对涉及两个目标脑区的两个静息状态感兴趣的脑网络的影响。它们是1)突出网络，包括dACC和前岛，2)默认模式网络，包括PCC，内侧前额叶皮层和双侧角回。我们首先使用独立分量分析确定了感兴趣网络的组平均空间图。然后，我们使用双重回归方法为每个主题、会话和运行生成特定主题的组平均空间地图和相关时间序列版本。简而言之，这涉及到将群体平均的空间地图集回归到每个受试者的4D时空数据集中，给出一组特定于受试者的时间序列，每个群体级别的空间地图。接下来，将这些时间序列回归(作为多元回归中的时间回归量)到相同的4D数据集中，得到一组特定主题的空间地图，每个组级空间地图一个。然后，我们使用FSL的随机排列测试工具和5000种排列测试会话差异。

4.8 探索性分析:GABA与功能连接变化的关系以及与模拟原位TUS强度的关联

我们使用Pearson相关性研究了TUS介导的GABA变化与PCC的功能连接是否相关。首先，我们对区域内的平均功能连接强度进行采样，显示每个rsfMRI运行的连接存在显著差异。PCC和假手术之间功能连通性的差异与PCC和假手术之间GABA的差异相关。以常规α值p<0.05评估相关性的显著性。颅骨对目标位置的TUS强度有很大的衰减和像差，衰减量因个体颅骨结构和目标深度的不同而不同。如上所述，我们使用Pearson相关性探讨了模拟TUs强度与病灶体积以及个体间MRS和rsfMRI测量之间的关系。

参考文献：Transcranial focused ultrasound-mediated neurochemical and functional connectivity changes in deep cortical regions in humans