Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity

（NeuroToxicology 3区，港大 25）
1.简介 SY5Y是一种多巴胺能神经元细胞系。RA的分化表现为神经突广泛生长，神经元细胞核、神经元特异性烯醇化酶、突触球蛋白、突触相关蛋白-97表达增加，分化抑制剂-1表达减少。
细胞培养：接种后48小时内，10%热灭活牛血清的培养基培养。之后换3%热灭活血清，10μMRA培养起七天。做蛋白印迹时，按2105cells/孔的密度接种到6孔板中。MTT以1104cells/孔接种在96孔板中。免疫荧光染色，分化细胞以2.5*104cells/孔接种在4-well chamber slide中。细胞在无涂层培养基中培养。
2.实验技术 MTT 蛋白印迹 神经毒性检验 C阿生怕色-3-like的分析 神经特异性物质的免疫化学分析
3 结果
3.1 Differentiation properties of retinoic acid
为验证RA对SY5Y的诱导分化作用，RA处理24后第2-7天，持续观察神经突的伸长，并做了蛋白印迹和免疫荧光检测。

3.2. Western-blot analysis on the changes in neuronal marker levels by RA
确认RA能够引起SY5Y分化后，做了蛋白印迹分析，测蛋白表达水平的变化。测量了NSE、突触球蛋白、突出后相关蛋白97（SAP97）、NeuN、NF、MAP2和多巴胺能神经元的标志物DAT和TH。NSE、突触球蛋白（突触泡上一种丰富的完整膜蛋白，参与神经递质的释放。检测该物质的变化来说明神经元功能的成熟与否）、突出后相关蛋白97（SAP97）、NeuN变化显著，NF、MAP2和多巴胺能神经元的标志物DAT和TH变化不显著（这里可以确定RA诱导SY5Y分化后不是多巴胺能神经元表型）。

3.3. Immunocytochemical analysis on the changes in neuronal marker levels by RA
为证实western-blot检测到的神经爱与标志物的变化，进行免疫细胞化学分析。比较为分化细胞和RA诱导细胞的NSE、突触素、SAP97、NF、TH（为何没有DAT）的荧光强度。未分化SY5Y的NSE主要集中在细胞质中，分化后在体和突出中的分布显著增加。突触球蛋白和SAP97细胞分化后，细胞体和神经细胞荧光强度明显增强。NF、TH的结果与蛋白印迹一致，无明显变化。

讨论：我们发现，ra介导的分化通过进一步调控其他成熟的神经元标记物来影响神经元的特性。euN在成熟神经元上表达，是成熟神经元的标志。SY5Y因表达多巴胺能神经元的特征而被用于研究PD的模型。在我们的实验中，DAT和TH的表达与RA的诱导无关。RA诱导的SY5Y分化后神经元标志物的表达是有限的。综上所述，RA通过改变特异性神经标记物来分化SH-SY5Y。然而，考虑到多巴胺能性质无明显变化，RA调节Akt通路，对6-OHDA毒性耐受性较高，未分化SH-SY5Y可能更适合在实验性PD研究中研究神经毒性或神经保护。（该文章还涉及到一些分子通路的实验，未作仔细阅读）。