最终分化的SH-SY5Y细胞为研究多巴胺激动剂的神经保护作用提供了一个模型系统

Terminally Differentiated SH-SY5Y Cells Provide a Model System for Studying Neuroprotective Effects of Dopamine Agonists
（2004年 3区，亚利桑那州立大学 78）
摘要：我们对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系的未分化(UN)和三种分化条件（RA、TPA、TPA联合RA）诱导分化了的SY5Y细胞进行了多巴胺能细胞表型标志物的鉴定，对神经毒素1甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶离子(MPP+)的敏感性，利用多巴胺(DA)转运体(DAT)对MPP+毒性的需求，以及普拉米索的神经保护作用。RA/TPA诱导的SY5Y细胞的TH和DAT表达显著增高。囊泡单胺转运体表达水平较低。RA/TPA分化细胞对MPP+ (0.03 ~ 3.0 mM)的神经毒性作用高度敏感，而MPP+的神经毒性作用被DAT抑制剂1-(2[双(4-氟苯基)甲氧基]乙基)-4-(3-苯基丙基)哌嗪阻断。RA诱导分化的细胞对da诱导的细胞死亡在相对于RA/TPA诱导分化细胞并不敏感，也不受转运蛋白抑制剂的抑制。RA/TPA分化细胞的DAD2（该受体更倾向于DA激动剂，应关注）和D3受体水平分别比未分化细胞高3倍和6倍。普拉克索（pramipexole）预处理对RA/TPA分化细胞的MPP+有保护作用，对未分化细胞和RA分化细胞无保护作用。普拉克索的神经保护作用呈浓度依赖性，多巴胺D2/D3受体依赖性。相反，普拉克索（pramipexole）对DA的保护不依赖于DA受体。
前言：在PD模型中，DA gonists（多巴胺激动剂）被证明用于治疗PD时，具有神经保护作用。许多抗帕金森药物是DA激动剂（设计一个关于rTMS对DA激动剂表达的实验和rTMS联合DA激动剂共同作用的实验）的直接作用，也表现出神经保护作用。给小鼠注射MPTP被认为是研究神经保护的一个很好的模型，因为已知MPTP通过选择性丢失SN的DA-ergic神经元，在人类和亚人类物种中产生帕金森症。（可考虑设计MPTP诱导帕金森模型的过程中对小鼠施加rTMS的实验。或以体外培养细胞模型为材料的rTMS试验）。MPP+是MPTP的活性代谢产物。阐述了DA D3受体与DAT之间的关系，强调了DA D3受体的重要性。小鼠敲除D3受体基因后，普拉克索对MPTP毒性的保护作用降低。L-dopa（左旋多巴）可阻止神经毒素的产生，进而用于治疗PD。已证实普拉克索可预防中脑细胞培养中Ldopa和神经母细胞瘤SH-SY5Ycell系中MPP+产生的神经毒性（前文提到L-dopa为PD提供了有效治疗，如何理解？）。D3介导了普拉克索的神经保护作用。有人阻断了DA受体后，并未发现普拉克索的神经保护作用（使用的SY5Y细胞）。这可能与所用细胞和毒素不同。
L-dopa可以产生神经毒性，与MPP+毒性作用导致细胞死亡的同路可能不同。SY5Y表现出神经元特性和儿茶酚胺表型，能运输DA和NE，表达合成和代谢DA、乙酰胆碱的酶，表达DA和乙酰胆碱受体。高浓度的MPP+3天可使SY5Y出现形态学凋亡。我们认为MPP+诱导的细胞死亡需要SH-SY5Y细胞系通过DAT在细胞内积累。之所以未分化的细胞需要高浓度的MPP+产生毒素，可能与为分化细胞DAT表达水平低和单胺类囊泡转运体表达高有关。我们已经发现，用维甲酸(RA)和(TPA)分化的SH-SY5Y细胞表现出最明显的多巴胺能表型，MPP+诱导的毒性特征与体内DA神经元相似，以及针对MPP+的D3样受体依赖性神经保护。
Cell Culture：10%胎牛血清，接种在48孔培养板（25,000 cells/well）里。分为UN、RA（10μ M）、TPA（80 n M）、TPA/RA（先在RA中养3天，然后在TPA中养三天）四组，三天换液一次。
普拉克索处理：RA和RA/TPA诱导分化后的SY5Y，使用浓度为0-1.mM的普拉克索预处理三天，而后添加MPP+处理三天（或同时加入普拉克索和MPP+）。
MTT检测和细胞活力检测：4天的时间里，每隔24h做一次MTT（570nm波长处）检测。乳酸脱羟酶（LDH）测细胞活力，4天每隔24h用LDH测一次细胞膜的完整性。
免疫细胞化学：以50000cells/cm2的浓度接种在铺设多聚赖氨酸的玻璃片上。将RA、TPA/RA诱导分化的SY5Y用多聚甲醛在室温下固定一小时，然后用含有0.1%Triton X-100的TBS（25mM Tris， ,pH7.4，140mM NaCl；3mM KCl）处理。····做了MAP-2、TH、DAT、DA D3、DA D2、VMAT-2。
Western Blotting：T-25瓶子，增殖至50%，经RA和TPA诱导分化。PBS冲洗三次后，将细胞移除。贮存于-80℃中。···
RESULTS：
Phenotypic Characteristics of Differentiation
细胞分化后通常集中在大的团簇中，有许多细长的突起连接在团簇上，类似于外植体。RA/TPA分化的TH，D2和D3的受体、DAT、VMAT细胞免疫染色呈阳性。

FIGURE 1 Immunocytochemical detection of dopaminergic markers in RA/TPAdifferentiated SH-SY5YCells. Immunocytochemistry and confocal laser scanning microscopy were as described in Materials and Methods.
Panel A is RA/TPAcells incubated with rabbit anti-tyrosine hydroxylase polyclonal antibody.
Panel B is RA/TPAcells incubated rat anti-dopamine transporter monoclonal antibody.
Panel C is RA/TPAcells incubated with rabbit anti-vesicular monoamine transporter 2 polyclonal antibody.
Panel D is RA/TPAcells incubated with rabbit anti-dopamine D2 receptor polyclonal antibody.
Panel E is RA/TPAcells incubated with rabbit anti-dopamine D3 receptor polyclonal antibody.
Panels A1-E1 are RA/TPAcells incubated with mouse anti-MAP-2 monoclonal antibody.
Note that as compared to RAdifferentiated cells (FIG. 2) there are higher levels of TH (A) DAT (B) but lower levels of VMAT ©. Levels of D2 (D) and D3 (E) receptor levels also are higher in RA/TPAdifferentiated cells.
在这些生长于极低密度的细胞中，DAT免疫反应性在细胞的生长过程中被观察到(图3-B)，并且在较低密度的细胞中比在较高密度的细胞中生长时更明显。当以免疫印迹法(见下文)和神经毒性实验中使用的密度生长时，免疫反应活性水平要高得多，但仍以观察为主。相对于TPA/RA诱导而言，RA诱导的SY5Y细胞TH、DAT、D3受体的免疫反应非常弱，可以忽略不计，而VMAT很强。这与RA诱导的PC12细胞分化表现出胆碱能神经表型和多巴胺能标志物下降的结果一致。但SY5Y经RA诱导后，再使用TPA诱导，其多巴胺能表型非常明显。与未分化的细胞或RA单独处理相比，TPA/TPA或RA/TPA 6天分化使TH和DAT增加3倍和4倍。

与此相反，TPA/TPA分化和RA/TPA分化细胞的VMATas水平明显低于未分化细胞或单独RA诱导。

相对未分化细胞而言，RA、TPA/RA和TPA诱导分化的SY5Y MAP-2的表达有轻微显著。

虽然D2和D3受体的蛋白水平在UN细胞中几乎检测不到，但分化条件显著改变了其表达水平。RA、TPA和RA/TPA处理使D2受体蛋白水平升高，TPA/TPA分化和RA/TPA分化使D3受体数量分别增加3倍和6倍。

Discussion
S-N-SK细胞表达合成DA和NE的酶，据报道在体外培养的该细胞分泌的DA多于NE。MPP+引起的细胞凋亡与线粒体中ROS的形成、电子转运的中断、线粒体电位的崩溃、细胞色素c从细胞器向细胞质组分的释放以及DNA的梯状化有关。使用未分化的SH-SY5Y细胞作为多巴胺能神经元模型存在问题，因为DA合成酶没有高表达，MPP+的毒性不需要DAT，正在进行的有丝分裂可以显著影响药物和毒素的反应。RA诱导分化的SY5Y经TPA处理后DA合成酶和G-蛋白的表达显著升高。这一点可以通过免疫反应和蛋白印迹来证实。考虑到RA/TPA诱导分化SY5Y是否适合作为多巴胺能神经元PD模型，我们进一步确定TPA/RA诱导的SY5Y对MPP+浓度的敏感性比未分化的SY5Y低。Ra/TPA诱导分化的SY5Y加入DA激动剂后，几乎完全阻断了MPP+的毒性。这与未分化的SY5Y形成对比，但与中脑原代培养的多巴胺能神经元类似。我们的数据支持这样的观点，即DAT与VMAT的比值可以调节SH-SY5Ycells对MPP+的敏感性，就像在体内一样。RA/TPA诱导分化的SY5Y高水平表达的D2尤其是D3受体，对普拉克索介导的DA受体介导的保护是必要的。