Simultaneous——使用进化模型（EVcouplings）和优化算法（Gibbs采样）设计蛋白质变体

  论文链接：使用进化知情的蛋白质设计同时增强多种功能特性

概述

这篇论文通过使用进化模型（EVcouplings）和优化算法（Gibbs采样）设计出了一系列带有多重突变的蛋白质变体。这些变体不仅在实验中表现出显著增强的热稳定性和广泛的底物特异性，而且在结构上与野生型蛋白质保持了高度一致。该方法展示了通过计算设计来大幅度改变蛋白质序列，并同时提升多个功能属性的潜力。

结构

1、多序列比对与进化模型构建（Multiple Sequence Alignment and Evolutionary Model Construction）：

技术：多序列比对（Multiple Sequence Alignment, MSA）和最大熵模型（Maximum Entropy Model）。

解释：首先使用MSA工具（如jackhmmer）对14,793个与目标蛋白TEM-1 β-内酰胺酶同源的序列进行比对。基于比对结果，使用最大熵模型生成EVcouplings模型，捕捉序列中各个氨基酸位点及其对间相互作用的进化限制，从而预测序列适应性（fitness）。

2、序列设计与优化（Sequence Design and Optimization）：

技术：Gibbs采样（Gibbs Sampling）与目标函数优化。

解释：通过Gibbs采样迭代生成蛋白质变体序列。目标函数旨在最大化序列的进化适应性（EVH），并约束设计序列与野生型TEM-1的序列相似性，同时控制与自然同源序列及其他设计序列的相似度。

3、蛋白质设计的实验验证（Experimental Validation of Protein Designs）：

技术：分子克隆与表达、抗生素抗性测定、酶动力学分析、热稳定性分析、X射线晶体学。

解释：将设计的TEM-1变体克隆到表达载体中，转化至大肠杆菌，并通过抗生素抗性测定、酶动力学实验评估其功能。同时通过差示扫描荧光法（DSF）测定变体的热稳定性，并使用X射线晶体学解析高变体的三维结构，以评估其结构保守性。

模型介绍

使用基于进化的β-内酰胺酶蛋白家族统计模型来生成和测试设计变体。[A，计算模型 β-内酰胺酶] WT TEM-1 β-内酰胺酶用于生成多序列比对，该序列比对用作输入以导出 EVcouplings 最大熵模型。任何序列 (σ) 的预测适应度 (EVH) 可以计算为每对残基之间的耦合项 (Jij) 以及位点保守项 (hi) 之和。 [B，计算设计 β-内酰胺酶变体] 设计变体是通过使用吉布斯采样迭代优化目标函数来生成的，该目标函数考虑了 EVH 以及与 WT TEM-1、天然同源物以及其他设计序列的序列相似性。 [C，实验测试设计] 合成设计，克隆到质粒中，在大肠杆菌中表达，并执行几个实验方案来表征每个设计，包括基于细胞的活性测定、生化动力学评估以及结构测定和分析。

输入（编码）

• 蛋白质序列输入：使用MSA生成的多序列比对数据，通过最大熵模型计算序列的进化适应性分数（EVH），并输入到Gibbs采样算法中进行序列设计。
• 结构信息输入：根据已知的TEM-1三维结构数据，进一步辅助模型预测序列突变对蛋白质结构和功能的影响。

模型结构

• EVcouplings模型：基于最大熵原理，捕捉氨基酸之间的共进化关系。模型参数包括位点特异性项（hi）和成对相互作用项（Jij），用于量化蛋白质序列的适应性。
• Gibbs采样算法：模型通过迭代采样的方式优化设计序列，目标函数结合EVH得分、序列相似性和结构保守性多项指标。

训练

• 模型不需要传统意义上的训练，而是基于自然同源序列生成的EVcouplings模型直接用于设计序列。Gibbs采样则根据目标函数在设计空间中进行探索和优化。

模型输出

• 序列设计输出：模型输出为一系列经过优化的蛋白质序列，这些序列在保持原始功能的同时，引入了大量突变以增强特定的功能属性，如热稳定性和酶活性。
• 功能预测输出：模型预测了各个设计序列的适应性分数，并根据这些预测结果选出最优的设计进行实验验证。

总结

这项研究强调了进化模型在指导大序列改变以产生蛋白质设计应用的功能多样性方面的有效性。在保留功能的同时修饰酶或蛋白质一直是一项重大挑战。通常，对酶的一级结构的多次突变或修饰会对所得酶的三维结构和功能产生重大且破坏性的影响。利用已知信息并预测设计蛋白质的结构和功能的新方法对于有效推进蛋白质修饰研究是必不可少的。