Cell Reports｜单细胞6张图，非肿瘤T细胞分型这样做

今天给大家分享一篇IF=8.8的单细胞的文章，2023年5月发表在Cell Reports：Psoriatic and rheumatoid arthritis joints differ in the composition of CD8+ tissue-resident memory T cell subsets，银屑病关节炎和类风湿关节炎的关节在CD8+组织驻留记忆T细胞亚群的组成上存在差异

摘要

CD69+CD103+组织驻留记忆T（TRM）细胞是炎症的重要驱动因素。为了解析它们在炎性关节炎中的作用，我们对银屑病性关节炎（PsA）或类风湿关节炎（RA）患者关节中的T细胞进行了单细胞、高维度分析。我们确定了三组滑膜CD8+CD69+CD103+ TRM细胞：细胞毒性和调节性T（Treg）-类TRM细胞存在于PsA和RA中，而具有促炎细胞因子特异性分泌（IL-17A+TNFα+IFNγ+）的CD161+CCR6+17型TRM细胞在PsA中特别丰富。相反，在两种疾病中仅检测到一种CD4+CD69+CD103+ TRM细胞群，且频率相似且较低。17型CD8+ TRM细胞具有独特的转录组特征和多克隆但不同的TCR重排。在PsA中，17型细胞还富集于CD8+CD103−T细胞中，与RA相比。这些发现说明了PsA和RA的免疫病理学差异，特别是在PsA关节中17型CD8+ T细胞的富集。

关键词：CD103、CD8+ T细胞、TRM、Tc17细胞、CyTOF、scRNA-seq、关节、滑膜液、银屑病性关节炎、类风湿关节炎

研究思路

结果

图1 鉴定出在银屑病性关节炎（PsA）和类风湿性关节炎（RA）患者中存在不同群体的滑膜CD8+CD69+CD103+和CD4+CD69+CD103+ TRM细胞

来自银屑病性关节炎（PsA）（n = 8）或类风湿性关节炎（RA）（n = 5）患者的滑膜液CD3+T细胞被染色以及带有面板I（无刺激）; 活的CD8+和CD4+ T细胞被分门别类并独立分析; 显示了来自CD8+ T细胞（左列）和CD4+ T细胞（右列）的数据。

• (A) PsA（红色）和RA（蓝色）样本的MDS图; 聚类基于所有标记中位数表达。

• (B) 基于32个标记的arcsinh转换表达在总CD8+（左）和CD4+（右）T细胞中进行UMAP分析。从每个样本中，随机选择了60,000个细胞。UMAP显示了按疾病分层的CD69（左列）和CD103（右列）的细胞表达水平：PsA（顶行）和RA（底行）。细胞基于表面和细胞内标记进行聚类。

• © 通过FlowSOM获得的15个群体的中位标记强度的热图。热图中的颜色和值表示了所有样本中的细胞上计算出的中位arcsinh转换，0-到1-缩放的标记表达; 通过平均连接的欧几里德距离计算得到的15个群体之间的层次相似性。沿着行和值的条形图显示了相对群体大小和ID。

• (D) 如（B）中生成的UMAP分析，根据疾病分层并显示根据FlowSOM获得的15个群体的细胞着色，如（C）中所表征的; 红色圈出了TRM细胞群体。

图2 与RA患者相比，PsA患者中滑膜CD8+CD69+CD103+ TRM细胞的多个群体富集

• (A 和 B) 累积数据显示来自图1C中的CD8+CD69+CD103+ (A) 和 CD4+CD69+CD103+ (B) TRM细胞群体的相对丰度，由CD69和CD103的共表达确定，分别在银屑病性关节炎（PsA）（红色）和类风湿性关节炎（RA）（蓝色）患者中; 箱线图显示中位数 ± 四分位距（IQR）; PsA（n = 8）和RA（n = 5）的数据由广义线性混合模型（GLMMs）分析，报告p <0.05。

• (C 和 D) 跨过32个标记的CD8+CD69+CD103+ TRM细胞群体（C）和1个CD4+CD69+CD103+ TRM细胞群体（D）的中位标记强度的热图。热图细节如图1所示。每个CD8+CD69+CD103+ TRM细胞群体（C）和CD4+CD69+CD103+ TRM细胞群体（D）都计算生成了MEM标签（方框），并且在每个群体内使用所有其他群体作为参考，标记被分配为正（向上箭头）或负（向下箭头）富集值。集群定义标记以粗体突出显示。

图3 滑膜CD8+CD69+CD103+ TRM细胞群体的细胞因子表达谱

滑膜液CD3+T细胞在存在GolgiStop的条件下与PMA/ionomycin刺激3小时，并使用面板II染色; 活的CD8+ T细胞被分门别类并分析。

• (A) 基于在银屑病性关节炎（PsA）（n = 7）或类风湿性关节炎（RA）（n = 4）患者的总CD8+ T细胞中评估的33个标记的arcsinh转换表达进行的UMAP分析。从每个样本中随机选择了38,000个细胞。UMAP显示了按疾病分层的CD69（左列）和CD103（右列）的细胞表达水平：PsA（顶行）和RA（底行）。细胞基于表面和细胞内标记进行聚类。

• (B) 跨过FlowSOM获得的15个细胞群体的中位标记强度的热图，如图1所示。

• © 如（A）中生成的UMAP分析，根据疾病分层并显示根据FlowSOM获得的15个细胞群体的细胞着色，如（B）中所表征的; 红色圈出了TRM细胞群体。

• (D) 来自（B）的CD8+CD69+CD103+ TRM细胞群体的相对丰度的累积数据，由CD69和CD103的共表达确定，分别在PsA（红色）和RA（蓝色）患者中。箱线图显示中位数 ± IQR; 数据由GLMMs分析，报告p <0.05。

• (E) 跨过（B）获得的5个TRM细胞群体的中位标记强度的热图。如图2所述，为每个5个CD8+CD69+CD103+ TRM细胞群体列出的MEM标签（方框）。

图4 单细胞RNA测序分析定义了银屑病性关节炎患者滑膜液中TRM群体的独特特征

使用10×对银屑病性关节炎（PsA）患者（n = 4）的SFMC样本进行独立测序。

• (A) UMAP显示PsA患者CD8+ T细胞中CD69（左）和CD103（右）的细胞蛋白（顶行）和基因（底行）表达水平。

• (B) UMAP显示根据Seurat聚类获得的18个群体着色的细胞。

• © 小提琴图显示Seurat群体中CD69（左）和CD103（右）的细胞蛋白（顶行）和基因（底行）表达水平。

• (D) GSEA图，比较群体4（左）、6（中）和13（右）与所有其他群体的肺CD8+ TRM签名; 每组n = 4。显示了GSEA的归一化富集分数（NES）和多重检验调整的q值。

• (E) 点图显示了通过CyTOF定义的特定TRM群体的蛋白或基因表达，在©中确定的3个CD69+CD103+群体中。点图热图显示了指定基因或蛋白的平均表达（颜色）和表达该基因或蛋白的细胞百分比（大小）。

• (F) 显示与所有其他群体相比在群体4（左）或6（右）中显着差异表达的基因的火山图。使用Seurat中的FindMarkers函数进行Wilcoxon秩和检验计算差异表达的基因，并显示为蓝色（q < 0.05）或红色（q < 0.05，具有±1.2倍的变化）。

• (G) 热图显示与群体4相比，群体6中前30个上调和下调基因（q < 0.05）的归一化平均表达。

• (H 和 I) GSEA图比较PsA滑膜液（SF）CD8+HLA-DRhi签名（H）和与皮肤Tc17和皮肤CD8+CD49− TRM签名相比，群体6与群体4（I）; 每组n = 4。

图5 银屑病性关节炎患者滑膜CD8+ T细胞中的有限克隆重叠

• (A) 图4B中每个群体的反Pielou克隆性得分，每个供体（n = 4）包含> 100个TCR序列; 反Pielou分数从0到1，其中0表示高度多克隆群体，1表示单克隆群体; 箱线图显示中位数 ± IQR。

• (B) 与其他群体（n = 4）相比，群体4（左）或6（右）的Morisita分数; 箱线图显示中位数 ± IQR; 为了比较分数，自由线条在分数为0.4处绘制。

• © TRM群体谱和每个TRM群体与CD8+CD103− T细胞群体的Morisita分数比较（n = 4）; 箱线图显示中位数 ± IQR。

• (D) 代表性扇形图显示了在群体之间共享的前10个克隆的比例; 连接群体的扇形以共享克隆着色。

图6 银屑病性关节炎患者滑膜液中常规17型CD8+ T细胞的富集

• (A 和 B) 累积数据显示与银屑病性关节炎（PsA）（n = 8，红色）或类风湿性关节炎（RA）（n = 5，蓝色）患者相比，来自图1C的CD8+（A）和CD4+（B）CD103− T细胞群体的相对丰度。箱线图显示中位数 ± IQR; 数据由GLMMs分析，报告p <0.05。

• (C 和 D) 热图和MEM模型显示了来自（A 和 B）中显着富集（在PsA或RA中）的CD8+CD103−（C）或CD4+CD103−（D）细胞群体的32个标记的中位标记强度。热图和MEM细节如图1和2所述。

总结

• 主要数据及方法：

Types	Notes
数据资源	抗体“们”（列表参考原文）；单细胞数据：8名PsA患者和5名RA患者
实验技术	细胞分离；流式上样标准流程；
生信方法	CyTOF数据分析；单细胞标准流程；GSEA富集；单细胞TCR流程

• 这篇文章分析方法上并没有太大亮点，但能上cell reports也有其道理，就是PsA和RA的T细胞分型。笔者查了下，阵容强大，通讯作者Taams教授是在免疫学上专耕T细胞的大牛～
• 该文章方法是传统方法，但是切入点十分值得大家学习和借鉴