《生物化学与分子生物学》----核酸----听课笔记（十三）

第十四章  核酸的物理化学性质

6.3.1 核酸的物理化学性质（1）

• 对酸的敏感性：糖苷键>磷酸酯键; 嘌呤糖苷键>嘧啶糖苷键
• 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成
• RNA的磷酸酯键对碱敏感
• DNA抗碱水解：DNA更稳定，遗传信息；RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
• 酶水解：非特异的磷酸二酯酶
• 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA、RNA，得5' -核苷酸
• 牛脾磷酸二酯酶水解DNA、RNA，得3' -核苷酸
• 特异的磷酸二酯酶称核酸酶
• 核酸酶根据底物专一性分类：核糖核酸酶 RNase；脱氧核糖核酸酶 DNase
• 根据作用方式分类：核酸外切酶、核酸内切酶、单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶。
• RNase H： 作用于DNA-RNA中的RNA链
• 牛胰核糖核酸酶，RNase I
• 高度专一的内切酶：RNase T1，耐热、耐酸，来源于米粬
• DNase：核酸酶S1，作用于单链DNA部分。
• 牛胰脱氧核糖核酸酶，DNase I：切断双链或单链DNA
• DNA限制性内切酶：来源于细菌，主要降解外源DNA，具有严格的碱基专一性。
• N-糖苷酶：各种非特异或对碱基特异的N-糖苷酶
• 碱基的解离：嘧啶、嘌呤杂环中N以及各取代基具有结合、释放质子的能力----酸性/碱性解离。
• 糖苷的解离：戊糖可增强碱基的酸性解离；核糖中羟基也可发生解离。

6.3.2 核酸的物理化学性质（2）

• DNA或RNA的定量
• 判断核酸样品的纯度
• 判断DNA是否变性
• 核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。
• 核酸的变性、复性和杂交
• 变性：在物理、化学因素影响下，DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，这是一个跃变过程。
• 变性DNA伴有A260增加（增色效应）、粘度降低、浮力密度增高、功能丧失。
• Tm溶解温度：DNA的变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中达到最大值一半时的温度称为该DNA的溶解 温度，用Tm表示。
• Tm的大小与DNA分子钟（G+C）的百分含量成正相关，测定Tm值可推算核酸碱基组成及判断DNA纯度。
• DNA的Tm值大小与DNA的均一性和G-C含量、介子中的离子强度有关。
• 复性：在一定条件下，变性DNA单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有减小（减色效应），DNA的功能恢复。

第十五章   核酸的研究方法

6.4.1 核酸的研究方法（1）

• 核酸制备的原则：核酸制备中共同需要注意的问题是防止核酸的降解和变性，要制备天然 状态的核酸，必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的防止核酸酶的作用。
• DNA的分离：浓盐法
• 分离总RNA：用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿提取
• 分离poly(A)mRNA:通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸亲和层析法
• 核酸含量的测定法：紫外分光光度法，定磷法，定糖法
• 核酸的超速离心
• 用氯化铯密度梯度沉降平衡法可用于：核酸密度测定，DNA中G-C含量测定，溶液中核酸构象研究，核酸制备。
• 核酸的核苷酸序列测定：酶法测序；化学测序法

6.4.2 核酸的研究方法（2）

• DNA聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction PCR）
• PCR是1985年由Mullis提出。PCR是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。该反应是一段指数式反应。
• PCR反应成分：

1. 模板DNA
2. 引物
3. 四种脱氧核糖核苷酸
4. DNA聚合酶
5. 反应缓冲液、Mg2+等

• PCR反应基本步骤：变性，退火，延伸
• DNA的化学合成
• 合成时所用单体不是脱氧核苷三磷酸，而是核苷酸的亚磷酰胺衍生物。
• DNA微阵列技术
• DNA微阵列（DNA microarray）又称DNA阵列或DNA芯片、基因芯片，是以硅、玻璃微孔滤膜等为承载片，通过微加工技术，在数平方厘米之面积上固定数千或数万个核酸探针，经由一次测验，即可提供大量基因序列相关资讯。
• DNA微阵列的类型：不同生物体来源的基因片段；cDNA或EST; 合成的寡聚核苷酸
• 核酸的杂交检测
• 检测分析
• DNA芯片技术的应用：测定基因型、基因突变和多态性；DNA测序；测定基因表达谱。