原代细胞培养攻略，学会正确操作，成功培养高质量细胞

实验原理
鼠胚原代培养是一种原代培养类型，指从孕鼠中取出合适胎龄的胎鼠，从特定组织中分离出细胞，并在适宜条件下进行增殖培养，直到它们占据所有可用的基质（即达到汇合状态）。在此阶段，必须将细胞转移到含有新鲜生长培养基的新容器中进行继代培养（即传代），以提供更多的继续生长空间。

实验步骤
1、鼠胚原代培养：
1.在做实验之前，需要将超净工作台或生物安全柜的紫外灯提前照射30分钟。
1.2.实验材料准备：采用怀孕的母鼠作为材料，采用颈椎脱臼的方式进行安乐死，然后把整个鼠体浸泡在盛有纯酒精的烧杯中，时间为1分钟。随后将母鼠放置在不锈钢手术盘里，采用无菌手术剪打开其腹腔，取出鼠胚并放入无菌培养皿中。请注意，取样过程应在无菌操作台外进行。
1.用70-75%的酒精擦拭装有鼠胚的培养皿外围后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中。采用含有双抗Hanks液的洗涤鼠胚，并进行多次洗涤以去除血液污渍。在体视显微镜下进行操作，采用无菌手术器械去除过多组织，并用解剖镊剖取所需要的组织。将组织转移到含有解离液或培养基的50ml离心管中，采用眼科剪将组织剪碎成1立方毫米的肉糜状。
1.将解离液或培养基加入含有组织的50毫升离心管中，直至达到10毫升容量。首先采用10毫升弯头滴管对组织进行5-10次的吹打操作，然后使用1毫升的枪头对组织吹打，最后采用200微升的尖端进行吹打。
1.将上述组织悬液采用70μm过滤器过滤，以切碎和分散组织悬浮液，然后以l200rpm的速度，在4℃下离心10分钟。
1.将以前的培养基弃掉，用预先配好的培养基重悬细胞，并接种到经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中。把它置于37℃、5%CO2培养箱中，三天后更换培养液。之后每两天需要更换细胞培养液。

传代培养
2.在进行实验之前，一定要提前将超净工作台或生物安全柜的紫外灯照射30分钟以确保清洁。同时，在进行实验时，还需要用酒精擦拭消毒双手。
2.将原有培养的细胞培养瓶倒置放在显微镜下，仔细观察细胞的形态，以确定是否需要进一步进行传代培养。
2.1.采用酒精棉球擦拭操作台，点燃酒精灯，将培养瓶口火烧消毒；
2.用酒精棉球清洁操作台，点亮酒精灯，让培养瓶口经过火烧消毒；
3.利用酒精棉球擦拭操作台，将酒精灯点燃，用火烧消毒培养瓶口；
4.采用酒精棉球清洁操作台，点燃酒精灯，将培养瓶口进行灼烧消毒；
5.用酒精棉球擦拭操作台，将酒精灯点燃，对培养瓶口进行火烧消毒；
2.倒掉培养瓶中的旧培养基，并保留贴壁生长的细胞。
2.在培养瓶中加入适量0.25%的胰酶，让其刚好覆盖住贴壁生长的细胞。然后拧紧瓶盖，将培养瓶放入37℃的培养箱中，保持5分钟时间。在这段时间里，如果通过显微镜观察，可以看到细胞的突起会收回，并变成圆形。
2.取出培养瓶后，轻轻地摇动或吹打培养瓶，使细胞从瓶壁上脱离，然后把细胞悬液转移到离心管中。将离心管放在4℃的离心机中，以800rpm的速度离心5分钟。
2.将离心管中的上清弃掉，然后把细胞悬浮在细胞培养基中，接着把它移植到经过多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中。之后，将培养瓶或培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。这样，细胞便可以继续分裂并传代。

注意事项
1、进行原代培养时，请注意以下事项：
1）在进行原代培养时，要特别注意无菌操作，并在采用之前对工具进行高压灭菌处理。
2）由于鼠胚原代培养时，因为组织较少，所以建议在冷光源体视显微镜下进行操作；
3）原代细胞培养过程时间比较长，最短需要一周以上的时间。如果在培养2天后，培养基出现发黄现象，并且没有漂浮物，可以排除污染，是很正常的现象，是由于细胞在贴壁生长过程中所释放出来的。