使用vsearch进行16s扩增子高通量序列分析步骤_vsearch安装(1)

先自我介绍一下，小编浙江大学毕业，去过华为、字节跳动等大厂，目前阿里P7

深知大多数程序员，想要提升技能，往往是自己摸索成长，但自己不成体系的自学效果低效又漫长，而且极易碰到天花板技术停滞不前！

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正文

基于barcode分离出的样品序列单独再次翻转，并加上label后缀

vsearch --fastx_revcomp barcode.relabel.16S1.fq --label_suffix _RC --fastqout barcode.relabeled.16S1_rc.fq

  再利用反向barcode提取分样：

###这里的反向barcode特征序列和样品barcode按自己实际替换。
python /nfs/sopt/py/fastq_strip_barcode_relabel2.py barcode.relabeled.16S1_rc.fq GGACTACHVGGGTWTCTAAT barcode_16S_r2.txt B16s > mergedFR.relabeled2.16S1.fq

将同一批不重复样品的所有正反分样的序列合并到一起进行otu分析和物种分类 

###合并所有已标记样品名称的序列
cat mergedFR.relabeled2.16S1.fq mergedFR.relabeled2.16S1.fq {…} > mergedFR.relabel.16s.fq

###fastq过滤，去除读长较短的序列
vsearch --fastq_filter mergedFR.relabel.16s.fq --fastq_maxee 0.5 --fastq_minlen 250 --fastq_trunclen 250 --fastq_maxns 1 --fastaout mergedFR.relabel.16S.QC.fa

###获取无重复序列unique_seqs
vsearch --derep_fulllength mergedFR.relabel.16S.QC.fa --sizeout --relabel Uniq --output unique_seqs.fa

###unique序列排序，加速后续分析
vsearch --sortbysize unique_seqs.fa --output sorted.16s.fa --minsize 2

###使用unoise3处理输出otu序列和tab表，新版本特性
###现在版本的vsearch还是alpha版本，所以先用usearch开放版本处理
usearch -unoise3 sorted.16s.fa -zotus zotus.fa -tabbedout uniose3.txt

###同样使用usearch开放版本处理uniose3聚类模块，获取otutable
usearch -unoise3 unique_seqs.fa -zotus ref_zotus.fa -minsize 9
usearch -otutab mergedFR.relabel.16S.QC.fa -zotus zotus.fa -otutabout otu_table_16S_unoise3.txt

###同样可以使用vsearch的usearch-global模块获取数据otu丰度表
vsearch --usearch_global mergedFR.relabel.16S.QC.fa --db zotus.fa --id 0.99 --otutabout otus_counts.txt

###使用rdp数据库的classifier进行物种分类，可按服务器实际资源调整内存
java -Xmx8g -jar /rdp_classifier_2.12/dist/classifier.jar classify -c 0.5 -f filterbyconf -o classification.filterbyconf.16s.txt zotus.fa

   


以下是私房菜，全vsearch分析流程，可放入脚本直接运行，敬请收藏：

###python脚本环境需要py2，使用前可以先使用conda激活conda环境，或者直接在py2环境下运行
###序列文件，barcode及特征序列请根据自己实际修改；

vsearch --version
echo ---------------------------------------------
date
echo Mergepairs and relabel with “@”
vsearch --fastq_mergepairs ./datalink/fastq_1.fq
–reverse ./datalink/fastq_2.fq
–fastqout a.merged.fq
–relabel @
echo Mergepairs over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
vsearch --fastx_revcomp a.merged.fq
–label_suffix _RC
–fastqout a.merged_rc.fq
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
cat a.merged.fq a.merged_rc.fq > a.mergedFR.fq
echo --------------------------------------------
python ./testlink/py/fastq_strip_barcode_relabel2.py a.mergedFR.fq
GGACTACHVGGGTWTCTAAT ./datalink/barcode_16S.txt B16S > b.barcode.16S.fq
echo Barcode_16S over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
echo Revcomp 16s start
vsearch --fastx_revcomp b.barcode.16S.fq
–fastqout c.barcode.16S_rc.fq
echo Revcomp 16s over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
cat b.barcode.16S.fq c.barcode.16S_rc.fq > c.barcode.16S_FR.fq

echo Fastq filter start!
vsearch --fastq_filter c.barcode.16S_FR.fq
–fastq_maxee 0.5
–fastq_minlen 250
–fastq_trunclen 250
–fastq_maxns 1
–fastaout d.barcode.16S_FR.QC.fa
echo Fastq filter over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
echo Derep start! Dereplicate across samples and remove singletons.
vsearch --derep_fulllength d.barcode.16S_FR.QC.fa
–output e.dereped.16S.fa
–sizeout
echo Derep over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
echo Sortbysize!
vsearch --sortbysize e.dereped.16S.fa
–output f.sorted.16S.fa
–minsize 2
echo ---------------------------------------------
echo Cluster_size start! Precluster at 97% before chimera detection.
vsearch --cluster_size f.sorted.16S.fa
–id 0.97
–strand plus
–sizein
–sizeout
–relabel OTU_
–uc g.cluster_size.16S.uc
–centroids g.cluster_size.16S.fa
echo Cluster_size over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
echo De novo chimera detection.
vsearch --uchime_denovo g.cluster_size.16S.fa
–sizein
–sizeout
–nonchimeras h.denovo.nonchimeras.16S.fa
echo Obtained unique sequences after de novo chimera detection.
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
echo Usearch_global work start!
vsearch --usearch_global d.barcode.16S_FR.QC.fa
–db h.denovo.nonchimeras.16S.fa
–strand plus
–id 0.97
–maxaccepts 4
–maxrejects 128
–uc i.map_rdp_16s.uc
echo Global over!
date
echo ---------------------------------------------
echo Convert .uc to .txt
python ./testlink/py/uc2otutab.py i.map_rdp_16s.uc > j.OTU_table_16S.txt

最后的话

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