最新使用vsearch进行16s扩增子高通量序列分析步骤_vsearch安装(1),秀出天际

最后的话

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python脚本参考,大家可自行到usearch或其他地方下载:扩增子分析中需要使用到的python脚本资源-CSDN文库

###注意python需Python2环境,脚本位置,barcode序列(这里用的是16S其中的典型序列之一,以及样品barcode文件,文件格式间下方:
python /py/fastq_strip_barcode_relabel.py mergedFR.16S1.fq GTGCCAGCMGCCGCGGTAA barcode.txt B16s > barcode.relabel.16S1.fq

###barcode.txt 格式
>F_2
AGTTCATACGGC
>F_3
TCGCTTTAACCT
>F_4

基于barcode分离出的样品序列单独再次翻转,并加上label后缀

###
vsearch --fastx_revcomp barcode.relabel.16S1.fq --label_suffix _RC --fastqout barcode.relabeled.16S1_rc.fq

再利用反向barcode提取分样:

###这里的反向barcode特征序列和样品barcode按自己实际替换。
python /nfs/sopt/py/fastq_strip_barcode_relabel2.py barcode.relabeled.16S1_rc.fq GGACTACHVGGGTWTCTAAT barcode_16S_r2.txt B16s > mergedFR.relabeled2.16S1.fq


将同一批不重复样品的所有正反分样的序列合并到一起进行otu分析和物种分类

###合并所有已标记样品名称的序列
cat mergedFR.relabeled2.16S1.fq mergedFR.relabeled2.16S1.fq {...} > mergedFR.relabel.16s.fq

###fastq过滤,去除读长较短的序列
vsearch --fastq_filter mergedFR.relabel.16s.fq --fastq_maxee 0.5 --fastq_minlen 250 --fastq_trunclen 250 --fastq_maxns 1 --fastaout mergedFR.relabel.16S.QC.fa

###获取无重复序列unique_seqs
vsearch --derep_fulllength mergedFR.relabel.16S.QC.fa --sizeout --relabel Uniq --output unique_seqs.fa

###unique序列排序,加速后续分析
vsearch --sortbysize unique_seqs.fa --output sorted.16s.fa --minsize 2

###使用unoise3处理输出otu序列和tab表,新版本特性
###现在版本的vsearch还是alpha版本,所以先用usearch开放版本处理
usearch -unoise3 sorted.16s.fa -zotus zotus.fa -tabbedout uniose3.txt

###同样使用usearch开放版本处理uniose3聚类模块,获取otutable
usearch -unoise3 unique_seqs.fa -zotus ref_zotus.fa -minsize 9
usearch -otutab mergedFR.relabel.16S.QC.fa -zotus zotus.fa -otutabout otu_table_16S_unoise3.txt

###同样可以使用vsearch的usearch-global模块获取数据otu丰度表
vsearch --usearch_global mergedFR.relabel.16S.QC.fa --db zotus.fa --id 0.99 --otutabout otus_counts.txt

###使用rdp数据库的classifier进行物种分类,可按服务器实际资源调整内存
java -Xmx8g -jar /rdp_classifier_2.12/dist/classifier.jar classify -c 0.5 -f filterbyconf -o classification.filterbyconf.16s.txt zotus.fa

以下是私房菜,全vsearch分析流程,可放入脚本直接运行,敬请收藏:

###python脚本环境需要py2,使用前可以先使用conda激活conda环境,或者直接在py2环境下运行
###序列文件,barcode及特征序列请根据自己实际修改;

vsearch --version
echo ---------------------------------------------
date
echo Mergepairs and relabel with "@"
vsearch --fastq_mergepairs ./datalink/fastq_1.fq \
        --reverse ./datalink/fastq_2.fq \
        --fastqout a.merged.fq \
        --relabel @
echo Mergepairs over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
vsearch --fastx_revcomp a.merged.fq \
        --label_suffix _RC \
        --fastqout a.merged_rc.fq
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
cat a.merged.fq a.merged_rc.fq >  a.mergedFR.fq
echo --------------------------------------------
python ./testlink/py/fastq_strip_barcode_relabel2.py a.mergedFR.fq \
       GGACTACHVGGGTWTCTAAT ./datalink/barcode_16S.txt B16S > b.barcode.16S.fq
echo Barcode_16S over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
echo Revcomp 16s start
vsearch --fastx_revcomp b.barcode.16S.fq \
        --fastqout c.barcode.16S_rc.fq
echo Revcomp 16s over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
cat b.barcode.16S.fq c.barcode.16S_rc.fq > c.barcode.16S_FR.fq

echo Fastq filter start!
vsearch --fastq_filter c.barcode.16S_FR.fq \
        --fastq_maxee 0.5 \
        --fastq_minlen 250 \
        --fastq_trunclen 250 \
        --fastq_maxns 1 \
        --fastaout d.barcode.16S_FR.QC.fa
echo Fastq filter over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
echo Derep start! Dereplicate across samples and remove singletons.
vsearch --derep_fulllength d.barcode.16S_FR.QC.fa \
        --output e.dereped.16S.fa \
        --sizeout
echo Derep over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
echo Sortbysize!        
vsearch --sortbysize e.dereped.16S.fa \
        --output f.sorted.16S.fa \
        --minsize 2
echo ---------------------------------------------
echo  Cluster_size start! Precluster at 97% before chimera detection.
vsearch --cluster_size f.sorted.16S.fa \
        --id 0.97 \
        --strand plus \
        --sizein \
        --sizeout \
        --relabel OTU_ \
        --uc g.cluster_size.16S.uc \
        --centroids g.cluster_size.16S.fa
echo Cluster_size over!
echo ---------------------------------------------
date
echo ---------------------------------------------
echo De novo chimera detection.
vsearch --uchime_denovo g.cluster_size.16S.fa \
        --sizein \
        --sizeout \
        --nonchimeras h.denovo.nonchimeras.16S.fa
echo Obtained unique sequences after de novo chimera detection.
echo ---------------------------------------------


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