第三次细胞生物学实验

第三次细胞生物学实验

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前言

细胞骨架的观察、细胞内DNA及RNA的显示

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一、细胞骨架的观察

1.1. 实验目的

1. 掌握细胞骨架观察的制备技术（考马斯亮蓝染色法）
2. 了解细胞骨架的结构特征

1.2. 实验原理

1. 细胞骨架是真核生物细胞中的重要结构，起细胞支架的作用，并参与胞内物质运输、细胞运动、分泌吸收、细胞通讯、有丝分裂等。

2. 细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，可分为微丝、微管和中间丝。

3. 当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束网状结构，就是细胞骨架。

4. 补充：

考马斯亮蓝R250和G250的区别

种类 灵敏度 特异性 颜色 用途
R250 高，染色慢，脱色干净 低 偏红 蛋白染色
G250 低，染色快，背景脱色不彻底 高 偏绿 蛋白定量

1.3. 实验仪器、材料和试剂

1. 仪器、用具：普通光学显微镜、载（盖）玻片、烧杯、镊子、吸水纸、擦镜纸
2. 材料：洋葱鳞茎
3. 试剂：M-缓冲液 、6mmol/L(pH6.8)磷酸缓冲液、1%Trition X-100、戊二醛、0.2%考马斯亮蓝R250

1.4. 实验方法与步骤

1、撕取洋葱鳞茎内表皮置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉。
2、吸取磷酸缓冲液，用1%TritonX-100处理20-30min。
3、吸去TritonX-100，用M-缓冲液洗3次，每次10min。
4、3%戊二醛固定0.5-1h。
5、pH6.8磷酸缓冲液洗3次，每次10min。
6、0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30min。
7、用蒸馏水洗1-2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。

1.5. 实验结果

1. 提供普通光学显微镜观察结果，再绘出植物细胞骨架微丝结构图

2. 分析和论述在光学显微镜下观察到的细胞骨架的形态特征

可以观察到内表皮是由长的多边形栅栏状细胞紧密排列而成。经过染色后，可以观察到被考马斯亮蓝R250着色的细胞骨架，细胞骨架呈现蓝紫色，且构成网状结构，排列较为致密，分布在细胞的大部分区域。此外，细胞核也被染成蓝紫色，蛋白成团，故染色较深，蛋白的排列紧密度要比细胞质骨架蛋白的高。

二、细胞内DNA及RNA的显示

2.1. 实验目的

1. 能准确描述Brachet反应的原理。

2. 能准确描述DNA和RNA去除有关的操作方法及其原理。

3. 能够应用形态学观察与细胞组分分析的方法初步设计细胞中某组分定位的实验。

2.2. 实验原理

Unna试剂，也称为甲基绿-派洛宁(MethyI green-Pyronin)，为碱性染料，

它能分别与细胞内的DNA、RNA结合而呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿和染色质DNA选择性结合显示绿色或蓝色;派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。

原因：

两种染料在混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现蓝绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色，但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色。

2.3. 实验仪器、材料和试剂

1. 仪器、用具：普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、吸水纸

2. 材料：洋葱鳞茎

3. 试剂：
   1）Unna试剂:甲基绿派洛宁染色液

   ●甲液: 2%甲基绿水溶液 6 ml、5%派洛宁水溶液 6 ml、蒸馏水16 ml

   ●乙液: 1 mol/L乙酸缓冲液(pH=4.8)16 ml

   甲、乙两液分别置4°C冰箱备用，用时甲乙两液混匀。

   2)1 mol/L乙酸缓冲液(pH=4.8)配方:
   A液:冰醋酸6 ml 加蒸馏水至100 ml。 B液:乙酸钠13.5 g加蒸馏水至100 ml。 取A液40 ml+ B液60 ml混匀即为pH=4.8。

2.4. 实验方法与步骤

1. 第一组

   ●(1)用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于载玻片.上。

   ●(2)滴一滴Unna试剂，染色30 min。

   ●(3)蒸馏水洗两次，吸水纸吸去多余的水分。

   ●(4)盖上盖玻片，镜检。

2. 第二组

   ●撕取洋葱鳞茎内表皮，经5%三氯乙酸75°C水浴处理10 min。 再经70%Z醇洗片刻，然后按步骤(1)-(4)制片观察。

3. 第三组

   ●撕取洋葱鳞茎内表皮，用0.1% RNA酶室温处理10~ 15 min。蒸馏水洗， 吸干，然后按步骤(1)~ (4)制片观察。

2.5. 实验结果

1. 显示细胞中RNA和DNA的分布，提供图片

第一组：（洋葱鳞茎内表皮经Unna试剂染色）

第二组：（洋葱鳞茎内表皮先三氯乙酸+乙醇处理，再Unna试剂染色

第三组：（洋葱鳞茎内表皮先用RNA酶处理，再经Unna试剂染色）

2. 手绘：

2.6. 实验分析

请分别解释5%三氯乙酸+70%乙醇、0.1%RNA酶两种实验处理的目的及去除原理

5%三氯乙酸+70%乙醇实验处理的目的：

目的是用来去除细胞内的DNA。
去除原理： 三氯乙酸能够与DNA中的碱基和磷酸骨架发生作用，使DNA凝固。乙醇则可以用来沉淀凝固的DNA，因为DNA在乙醇中不溶解。通过离心，可以将含有凝固DNA的沉淀分离出来，从而去除DNA。

0.1%RNA酶实验处理的目的：

目的是用来去除细胞内的RNA。
去除原理：RNA酶是一种能够分解RNA的酶，通过加入0.1%RNA酶，可以将细胞内的RNA降解，从而去除RNA，而DNA不会受到影响。

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总结

上德不德，是以有德；下德不失德，是以无德。

–2023-10-10 生物技术篇