EasyAmplicon (易扩增子)-扩增子高通量序列分析软件流程及脚本-详细使用方法——来自刘永鑫团队的秘籍_easyamplicon能分析上百个样本吗(1)

网上学习资料一大堆，但如果学到的知识不成体系，遇到问题时只是浅尝辄止，不再深入研究，那么很难做到真正的技术提升。

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一个人可以走的很快，但一群人才能走的更远！不论你是正从事IT行业的老鸟或是对IT行业感兴趣的新人，都欢迎加入我们的的圈子（技术交流、学习资源、职场吐槽、大厂内推、面试辅导），让我们一起学习成长！

### 序列去冗余 Dereplicate

并添加miniuniqusize最小为8或1/1M，去除低丰度噪音并增加计算速度

-sizeout输出丰度, --relabel必须加序列前缀更规范, 1s

vsearch --derep_fulllength temp/filtered.fa
–minuniquesize 10 --sizeout --relabel Uni_
–output temp/uniques.fa

#高丰度非冗余序列非常小(500K~5M较适合)，名称后有size和频率

### 聚类OTU/去噪ASV Cluster or denoise

#有两种方法：推荐unoise3去噪获得单碱基精度ASV，备选传统的97%聚类OTU(属水平精度)
#usearch两种特征挑选方法均自带de novo去嵌合体
#-minsize二次过滤，控制OTU/ASV数量至1-5千，方便下游统计分析

#方法1. 97%聚类OTU，适合大数据/ASV规律不明显/reviewer要求
#结果耗时1s, 产生508 OTUs, 去除126 chimeras
usearch -cluster_otus temp/uniques.fa -minsize 10
-otus temp/otus.fa
-relabel OTU_

#方法2. ASV去噪 Denoise: predict biological sequences and filter chimeras
#6s, 1530 good, 41 chimeras, 序列百万条可能需要几天/几周
usearch -unoise3 temp/uniques.fa -minsize 10
-zotus temp/zotus.fa

#修改序列名：Zotu为改为ASV方便识别
sed ‘s/Zotu/ASV_/g’ temp/zotus.fa > temp/otus.fa

查看otus.fa，序列名称都更改了。


![](https://img-blog.csdnimg.cn/direct/f51f20e0c7d7459c8749dc8fd690d726.png)


### 基于参考去嵌合 Reference-based chimera detect


这里如果去除嵌合体的话就需要有rdp的数据库了，需提前下载好

不推荐，容易引起假阴性，因为参考数据库无丰度信息

而de novo时要求亲本丰度为嵌合体16倍以上防止假阴性

因为已知序列不会被去除，数据库选择越大越合理，假阴性率最低

mkdir -p result/raw

方法1. vsearch+rdp去嵌合(快但容易假阴性)

可自行下载silva并解压(替换rdp_16s_v18.fa为silva_16s_v123.fa)，极慢但理论上更好

vsearch --uchime_ref temp/otus.fa
-db ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa
–nonchimeras result/raw/otus.fa

RDP: 7s, 143 (9.3%) chimeras; SILVA：9m, 151 (8.4%) chimeras

Win vsearch结果添加了windows换行符^M需删除，mac不要执行此命令，linux下应该也不需要

sed -i ‘s/\r//g’ result/raw/otus.fa

方法2. 不去嵌合，直接cp到指定工作目录

cp -f temp/otus.fa result/raw/otus.fa

### 特征表构建和筛选 Feature table create and filter


# OTU和ASV统称为特征(Feature)，它们的区别是：  
 # OTU通常按97%聚类后挑选最高丰度或中心的代表性序列；  
 # ASV是基于序列进行去噪(排除或校正错误序列，并挑选丰度较高的可信序列)作为代表性序列


#### 生成特征表

id(1)：100%相似度比对49.45%序列，1m50s

id(0.97)：97%相似度比对83.66%序列，1m10s(更高数据使用率，更快)

time vsearch --usearch_global temp/filtered.fa
  --db result/raw/otus.fa
  --id 0.97 --threads 4
    --otutabout result/raw/otutab.txt

#212862 of 268019 (79.42%)可比对

vsearch结果windows用户删除换行符^M校正为标准Linux格式

sed -i ‘s/\r//’ result/raw/otutab.txt
head -n6 result/raw/otutab.txt | cut -f 1-6 |cat -A

csvtk统计表行列

这里一定看好列数，是不是等于你的样品数；如果不等，一般是样品命名存在问题，具体看上面解释

csvtk -t stat result/raw/otutab.txt

#### 物种注释，且/或去除质体和非细菌 Remove plastid and non-Bacteria


 先统计otu表的特征数，包括每个样品的otu总数


其他pipeline的筛选可根据需求和喜好来吧，不确定或感觉没必要的掠过即可，直接统计otu表信息

物种注释-去除质体和非细菌/古菌并统计比例(可选)

RDP物种注释(rdp_16s_v18)更快，但缺少完整真核来源数据,可能不完整，耗时15s;

SILVA数据库(silva_16s_v123.fa)更好注释真核、质体序列，极慢耗时3h起

置信阈值通常0.6/0.8，vserch最低0.1/usearch可选0输出最相似物种注释用于观察潜在分类

vsearch --sintax result/raw/otus.fa
–db ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa
–sintax_cutoff 0.1
–tabbedout result/raw/otus.sintax

sed -i ‘s/\r//’ result/raw/otus.sintax
########################
#物种注释结果：
ASV_7 d:Bacteria(1.00),p:Bacteroidetes(1.00),c:Flavobacteriia(1.00),o:Flavobacteriales(1.00),f:Flavobacteriaceae(1.00),g:Flavobacterium(1.00) + d:Bacteria,p:Bacteroidetes,c:Flavobacteriia,o:Flavobacteriales,f:Flavobacteriaceae,g:Flavobacterium
ASV_5 d:Bacteria(1.00),p:Cyanobacteria/Chloroplast(1.00),c:Chloroplast(1.00),f:Chloroplast(1.00),g:Streptophyta(1.00) + d:Bacteria,p:Cyanobacteria/Chloroplast,c:Chloroplast,f:Chloroplast,g:Streptophyta
ASV_4 d:Bacteria(1.00),p:Proteobacteria(1.00),c:Betaproteobacteria(1.00),o:Burkholderiales(1.00),f:Comamonadaceae(1.00),g:Rhizobacter(0.98) + d:Bacteria,p:Proteobacteria,c:Betaproteobacteria,o:Burkholderiales,f:Comamonadaceae,g:Rhizobacter
ASV_3 d:Bacteria(1.00),p:Proteobacteria(1.00),c:Betaproteobacteria(1.00),o:Burkholderiales(1.00),f:Comamonadaceae(1.00),g:Rhizobacter(0.93) + d:Bacteria,p:Proteobacteria,c:Betaproteobacteria,o:Burkholderiales,f:Comamonadaceae,g:Rhizobacter
ASV_2 d:Bacteria(1.00),p:Proteobacteria(1.00),c:Betaproteobacteria(1.00),o:Burkholderiales(1.00),f:Comamonadaceae(1.00),g:Pelomonas(1.00) + d:Bacteria,p:Proteobacteria,c:Betaproteobacteria,o:Burkholderiales,f:Comamonadaceae,g:Pelomonas

#OTU表简单统计 Summary OTUs table
usearch -otutab_stats result/otutab.txt
-output result/otutab.stat

cat result/otutab.stat

207572  Reads (207.6k)
    18  Samples
  1363  OTUs

 24534  Counts
  4507  Count  =0  (18.4%)
  4229  Count  =1  (17.2%)
  3999  Count >=10 (16.3%)

   413  OTUs found in all samples (30.3%)
   576  OTUs found in 90% of samples (42.3%)
  1276  OTUs found in 50% of samples (93.6%)

Sample sizes: min 10425, lo 10953, med 11549, mean 11531.8, hi 11924, max 13209

####  等量抽样标准化 Normlize by subsample


这里主要是依赖R包了，使用R运行，可以脚本运行，或者直接将otutab\_rare.R文件打开在R终端或studio的交互窗口直接运行

#使用vegan包进行等量重抽样，输入reads count格式Feature表result/otutab.txt
#可指定输入文件、抽样量和随机数，输出抽平表result/otutab_rare.txt和多样性alpha/vegan.txt
mkdir -p result/alpha
Rscript ${db}/script/otutab_rare.R --input result/otutab.txt
  --depth 10000 --seed 1
  --normalize result/otutab_rare.txt
  --output result/alpha/vegan.txt

#再统计查看抽样后的信息
usearch -otutab_stats result/otutab_rare.txt
  -output result/otutab_rare.stat
cat result/otutab_rare.stat

#### 计算α多样性 calculate alpha diversity

使用USEARCH计算14种alpha多样性指数(Chao1有错勿用)

#details in http://www.drive5.com/usearch/manual/alpha_metrics.html
usearch -alpha_div result/otutab_rare.txt
  -output result/alpha/alpha.txt

#当然大家可使用自己的R程序来进行alpha多样性的计算

#### 计算稀释丰富度 calculate rarefaction richness

#稀释曲线：取1%-100%的序列中OTUs数量，每次无放回抽样
#Rarefaction from 1%, 2% … 100% in richness (observed OTUs)-method without_replacement https://drive5.com/usearch/manual/cmd_otutab_subsample.html
usearch -alpha_div_rare result/otutab_rare.txt
  -output result/alpha/alpha_rare.txt
  -method without_replacement

#预览结果
head -n2 result/alpha/alpha_rare.txt

#样本测序量低出现非数值"-"的处理，详见常见问题8
sed -i “s/-/\t0.0/g” result/alpha/alpha_rare.txt

#### 筛选高丰度菌 Filter by abundance

#计算各特征的均值，有组再求分组均值，需根据实验设计metadata.txt修改组列名
#输入文件为feautre表result/otutab.txt，实验设计metadata.txt
#输出为特征表按组的均值-一个实验可能有多种分组方式
#-h显示脚本帮助(参数说明)
Rscript ${db}/script/otu_mean.R -h

#scale是否标准化，zoom标准化总和，all输出全部样本均值，type计算类型mean或sum
Rscript ${db}/script/otu_mean.R --input result/otutab.txt
  --metadata result/metadata.txt
  --group Group --thre 0
  --scale TRUE --zoom 100 --all TRUE --type mean
  --output result/otutab_mean.txt

结果为全部和各组均值

head -n3 result/otutab_mean.txt

#如以平均丰度>0.1%筛选，可选0.5或0.05，得到每个组的OTU组合
awk ‘BEGIN{OFS=FS=“\t”}{if(FNR==1) {for(i=3;i<=NF;i++) a[i]=KaTeX parse error: Expected 'EOF', got '}' at position 24: … "OTU","Group";}̲ \     else {fo…i>0.1) print $1, a[i];}}’
    result/otutab_mean.txt > result/alpha/otu_group_exist.txt

head result/alpha/otu_group_exist.txt

cut -f 2 result/alpha/otu_group_exist.txt | sort | uniq -c

试一试：不同丰度下各组有多少OTU/ASV

可在 http://ehbio.com/test/venn/ 中绘图并显示各组共有和特有维恩或网络图

也可在 http://www.ehbio.com/ImageGP 绘制Venn、upSetView和Sanky

#### β多样性 Beta diversity

#结果有多个文件，需要目录
mkdir -p result/beta/

#基于OTU构建进化树 Make OTU tree, 4s
usearch -cluster_agg result/otus.fa -treeout result/otus.tree

#生成5种距离矩阵：bray_curtis, euclidean, jaccard, manhatten, unifrac
usearch -beta_div result/otutab_rare.txt -tree result/otus.tree
  -filename_prefix result/beta/

#### 物种注释分类汇总

#OTU对应物种注释2列格式：去除sintax中置信值，只保留物种注释，替换:为_，删除引号
cut -f 1,4 result/otus.sintax
  |sed ‘s/\td/\tk/;s/😕__/g;s/,/;/g;s/"//g’
  > result/taxonomy2.txt
head -n3 result/taxonomy2.txt

#OTU对应物种8列格式：注意注释是非整齐
#生成物种表格OTU/ASV中空白补齐为Unassigned
awk ‘BEGIN{OFS=FS=“\t”}{delete a; a[“k”]=“Unassigned”;a[“p”]=“Unassigned”;a[“c”]=“Unassigned”;a[“o”]=“Unassigned”;a[“f”]=“Unassigned”;a[“g”]=“Unassigned”;a[“s”]=“Unassigned”;
  split($2,x,“;”);for(i in x){split(x[i],b,"");a[b[1]]=b[2];}
  print $1,a[“k”],a[“p”],a[“c”],a[“o”],a[“f”],a[“g”],a[“s”];}’
  result/taxonomy2.txt > temp/otus.tax
sed 's/;/\t/g;s/.//g;’ temp/otus.tax|cut -f 1-8 |
  sed ‘1 s/^/OTUID\tKingdom\tPhylum\tClass\tOrder\tFamily\tGenus\tSpecies\n/’
  > result/taxonomy.txt
head -n3 result/taxonomy.txt

#统计门纲目科属，使用 rank参数 p c o f g，为phylum, class, order, family, genus缩写
mkdir -p result/tax
for i in p c o f g;do
  usearch -sintax_summary result/otus.sintax
  -otutabin result/otutab_rare.txt -rank KaTeX parse error: Expected group after '_' at position 31: … result/tax/sum_̲{i}.txt
done
sed -i ‘s/(//g;s/)//g;s/"//g;s/#//g;s//Chloroplast//g’ result/tax/sum_*.txt

列出所有文件

wc -l result/tax/sum_*.txt
head -n3 result/tax/sum_g.txt

#### 有参定量特征表

比对Greengenes97% OTUs比对，用于PICRUSt/Bugbase功能预测

mkdir -p result/gg/

usearch比对更快，但文件超限报错选附录14 vsearch比对

默认10核以下使用1核，10核以上使用10核

usearch -otutab temp/filtered.fa -otus ${db}/gg/97_otus.fa
    -otutabout result/gg/otutab.txt -threads 4

比对率80.0%, 1核11m，4核3m，10核2m，内存使用743Mb

head -n3 result/gg/otutab.txt

#统计
usearch -otutab_stats result/gg/otutab.txt -output result/gg/otutab.stat
cat result/gg/otutab.stat

#### 空间清理及数据提交


这个步骤应该放在最后文章撰写完成后再处理，因为有些中间文件可能需要调整参数重新处理，有些大文件不用再重复cp了，另外，提交数据也是在文章接收后才会用到。

#删除中间大文件
rm -rf temp/*.fq

分双端统计md5值，用于数据提交

cd seq
md5sum _1.fq.gz > md5sum1.txt
md5sum _2.fq.gz > md5sum2.txt
paste md5sum1.txt md5sum2.txt | awk ‘{print $2"\t"$1"\t"$4"\t"$3}’ | sed 's///g’ > …/result/md5sum.txt
rm md5sum
cd …
cat result/md5sum.txt

#### 统计分析及出图


##### Alpha多样性

#Alpha多样性箱线图，对于不同样品数的作图，建议单个运行后再逐个调整参数以使出图布局最佳

查看帮助

Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R -h

完整参数，多样性指数可选richness chao1 ACE shannon simpson invsimpson

Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index richness
  --input result/alpha/vegan.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --output result/alpha/
  --width 89 --height 59

使用循环绘制6种常用指数

for i in head -n1 result/alpha/vegan.txt|cut -f 2-;do
  Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index ${i}
    --input result/alpha/vegan.txt --design result/metadata.txt
    --group Group --output result/alpha/
    --width 89 --height 59
done
mv alpha_boxplot_TukeyHSD.txt result/alpha/

Alpha多样性柱状图+标准差

Rscript ${db}/script/alpha_barplot.R --alpha_index richness
  --input result/alpha/vegan.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --output result/alpha/
  --width 89 --height 59

1.2 稀释曲线

Rscript ${db}/script/alpha_rare_curve.R
  --input result/alpha/alpha_rare.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --output result/alpha/
  --width 120 --height 59

1.3 多样性维恩图

三组比较:-f输入文件,-a/b/c/d/g分组名,-w/u为宽高英寸,-p输出文件名后缀

bash ${db}/script/sp_vennDiagram.sh
  -f result/alpha/otu_group_exist.txt
  -a WT -b KO -c OE
  -w 3 -u 3
  -p WT_KO_OE

四组比较，图和代码见输入文件目录，运行目录为当前项目根目录

bash ${db}/script/sp_vennDiagram.sh
  -f result/alpha/otu_group_exist.txt
  -a WT -b KO -c OE -d All
  -w 3 -u 3
  -p WT_KO_OE_All

EVenn在线绘制维恩图 https://www.ehbio.com/test/venn

##### Beta多样性

2.1 距离矩阵热图pheatmap

添加分组注释，如2，4列的基因型和地点

cut -f 1-2 result/metadata.txt > temp/group.txt

以bray_curtis为例，-f输入文件,-h是否聚类TRUE/FALSE,-u/v为宽高英寸

-P添加行注释文件，-Q添加列注释

bash ${db}/script/sp_pheatmap.sh
  -f result/beta/bray_curtis.txt
  -H ‘TRUE’ -u 6.9 -v 5.6
  -P temp/group.txt -Q temp/group.txt

##### 主坐标分析PCoA

输入文件，选择分组，输出文件，图片尺寸mm，统计见beta_pcoa_stat.txt

Rscript ${db}/script/beta_pcoa.R
  --input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --label FALSE --width 89 --height 59
  --output result/beta/bray_curtis.pcoa.pdf

添加样本标签 --label TRUE

Rscript ${db}/script/beta_pcoa.R
  --input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --label TRUE --width 89 --height 59
  --output result/beta/bray_curtis.pcoa.label.pdf
mv beta_pcoa_stat.txt result/beta/

#####  限制性主坐标分析CPCoA

Rscript ${db}/script/beta_cpcoa.R
  --input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --output result/beta/bray_curtis.cpcoa.pdf
  --width 89 --height 59

添加样本标签 --label TRUE

Rscript ${db}/script/beta_cpcoa.R
  --input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --label TRUE --width 89 --height 59
  --output result/beta/bray_curtis.cpcoa.label.pdf

#####  物种组成Taxonomy

3.1 堆叠柱状图Stackplot

以门§水平为例，结果包括output.sample/group.pdf两个文件

Rscript ${db}/script/tax_stackplot.R
  --input result/tax/sum_p.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --color ggplot --legend 7 --width 89 --height 59
  --output result/tax/sum_p.stackplot

修改颜色–color ggplot, manual1(22), Paired(12) or Set3(12)

Rscript ${db}/script/tax_stackplot.R
  --input result/tax/sum_p.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --color Paired --legend 12 --width 181 --height 119
  --output result/tax/sum_p.stackplotPaired

批量绘制输入包括p/c/o/f/g共5级

for i in p c o f g; do
Rscript KaTeX parse error: Expected group after '_' at position 55: … result/tax/sum_̲{i}.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --output result/tax/sum_${i}.stackplot
  --legend 8 --width 89 --height 59; done

3.2 弦/圈图circlize

以纲(class,c)为例，绘制前5组

i=c
Rscript KaTeX parse error: Expected group after '_' at position 54: … result/tax/sum_̲{i}.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --legend 5

结果位于当前目录circlize.pdf(随机颜色)，circlize_legend.pdf(指定颜色+图例)

移动并改名与分类级一致

mv circlize.pdf result/tax/sum_KaTeX parse error: Expected group after '_' at position 55: … result/tax/sum_̲{i}.circlize_legend.pdf

3.3 树图treemap(参考)

多层级包含物种关系，输入特征表和物种注释，输出树图

指定包含特征数量和图片宽高，100个ASV耗时12s

Rscript ${db}/script/tax_maptree.R
  --input result/otutab.txt --taxonomy result/taxonomy.txt
  --output result/tax/tax_maptree.pdf
  --topN 100 --width 183 --height 118

##### 差异比较

1. R语言差异分析

1.1 差异比较

Error in file(file, ifelse(append, “a”, “w”)),输出目录不存在，创建目录即可

mkdir -p result/compare/

输入特征表、元数据；指定分组列名、比较组和丰度

选择方法 wilcox/t.test/edgeR、pvalue和fdr和输出目录

compare=“KO-WT”
Rscript ${db}/script/compare.R
  --input result/otutab.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --compare ${compare} --threshold 0.1
  --method edgeR --pvalue 0.05 --fdr 0.2
  --output result/compare/

1.2 火山图

输入compare.R的结果，输出火山图带数据标签，可指定图片大小

Rscript $db/script/compar{e}_{v}olcano.R--inputresult/compare/${compare}.txt
  --output result/compare/${compare}.volcano.pdf
  --width 89 --height 59

1.3 热图

输入compare.R的结果，筛选列数，指定元数据和分组、物种注释，图大小英寸和字号

bash $db/script/compar{e}_{h}eatmap.sh-iresult/compare/${compare}.txt -l 7
   -d result/metadata.txt -A Group
   -t result/taxonomy.txt
   -w 8 -h 5 -s 7
   -o result/compare/${compare}

1.4 曼哈顿图

i差异比较结果,t物种注释,p图例,w宽,v高,s字号,l图例最大值

图例显示不图，可增加高度v为119+即可，后期用AI拼图为KO-WT.heatmap.emf

bash $db/script/compar{e}_{m}anhattan.sh-iresult/compare/${compare}.txt
   -t result/taxonomy.txt
   -p result/tax/sum_p.txt
   -w 183 -v 59 -s 7 -l 10
   -o result/compare/${compare}.manhattan.p.pdf

上图只有6个门，切换为纲c和-L Class展示细节

bash $db/script/compar{e}_{m}anhattan.sh-iresult/compare/${compare}.txt
   -t result/taxonomy.txt
   -p result/tax/sum_c.txt
   -w 183 -v 59 -s 7 -l 10 -L Class
   -o result/compare/${compare}.manhattan.c.pdf

显示完整图例，再用AI拼图

bash $db/script/compar{e}_{m}anhattan.sh-iresult/compare/${compare}.txt
   -t result/taxonomy.txt
   -p result/tax/sum_c.txt
   -w 183 -v 149 -s 7 -l 10 -L Class
   -o result/compare/${compare}.manhattan.c.legend.pdf

1.5 单个特征的绘制

筛选显示差异ASV，按KO组丰度降序列，取ID展示前10

awk ‘$4<0.05’ result/compare/KO-WT.txt | sort -k7,7nr | cut -f1 | head

差异OTU细节展示

Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index ASV_2
  --input result/otutab.txt --design result/metadata.txt
  --transpose TRUE --scale TRUE
  --width 89 --height 59
  --group Group --output result/compare/feature_

ID不存在会报错： Error in data.frame(…, check.names = FALSE) : 参数值意味着不同的行数: 0, 18  Calls: alpha_boxplot -> cbind -> cbind -> data.frame

指定某列排序：按属丰度均值All降序

csvtk -t sort -k All:nr result/tax/sum_g.txt | head

差属细节展示

Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index Lysobacter
  --input result/tax/sum_g.txt --design result/metadata.txt
  --transpose TRUE
  --width 89 --height 59
  --group Group --output result/compare/feature_

1.5 三元图

#参考示例见：result\compare\ternary\ternary.Rmd 文档
#备选教程246.三元图的应用与绘图实战

##### STAMP输入文件准备

2.1 生成输入文件

Rscript ${db}/script/format2stamp.R -h
mkdir -p result/stamp
Rscript ${db}/script/format2stamp.R --input result/otutab.txt
  --taxonomy result/taxonomy.txt --threshold 0.01
  --output result/stamp/tax

可选Rmd文档见result/format2stamp.Rmd

2.2 绘制扩展柱状图和表

compare=“KO-WT”

替换ASV(result/otutab.txt)为属(result/tax/sum_g.txt)

Rscript ${db}/script/compare_stamp.R
  --input result/stamp/tax_5Family.txt --metadata result/metadata.txt
  --group Group --compare $compare--threshold0.1--method"t.test"--pvalue0.05--fdr"none"--width189--height159--outputresult/stamp/${compare}

可选Rmd文档见result/CompareStamp.Rmd

##### LEfSe输入文件准备

3.1. 命令行生成文件

可选命令行生成输入文件

Rscript ${db}/script/format2lefse.R -h
mkdir -p result/lefse

threshold控制丰度筛选以控制作图中的枝数量

Rscript ${db}/script/format2lefse.R --input result/otutab.txt
  --taxonomy result/taxonomy.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --threshold 0.4
  --output result/lefse/LEfSe

3.2 Rmd生成输入文件(可选)

#1. result目录中存在otutab.txt, metadata.txt, taxonomy.txt三个文件；
#2. Rstudio打开EasyAmplicon中format2lefse.Rmd，另存至result目录并Knit生成输入文件和可重复计算网页；

3.3 LEfSe分析

#方法1. 打开LEfSe.txt并在线提交 https://www.bic.ac.cn/BIC/#/analysis?page=b%27MzY%3D%27
#方法2. LEfSe本地分析(限Linux系统、选学)，参考代码见附录
#方法3. LEfSe官网在线使用

####  QIIME 2分析流程


代码详见 qiime2/pipeline\_qiime2.sh


#####  功能预测


## 1. PICRUSt功能预测


### PICRUSt 1.0

方法1. 使用 http://www.ehbio.com/ImageGP 在线分析 gg/otutab.txt

方法2. Linux服务器用户可参考"附录2. PICRUSt功能预测"实现软件安装和分析

然后结果使用STAMP/R进行差异比较

R语言绘图

输入文件格式调整

l=L2
sed ‘/# Const/d;s/OTU //’ result/picrust/all_level.ko.$l.txt>result/picrust/${l}.txt
num=head -n1 result/picrust/${l}.txt|wc -w
paste <(cut -f $numresult/picrust/${l}.txt) <(cut -f 1-$[num-1]result/picrust/${l}.txt)
  > result/picrust/$l.spfcut-f2-result/picrust/${l}.spf > result/picrust/${l}.mat.txt
awk 'BEGIN{FS=OFS=“\t”} {print $2,KaTeX parse error: Expected 'EOF', got '}' at position 2: 1}̲' result/picrus…{l}.spf | sed ‘s/;/\t/’ | sed ‘1 s/ID/Pathway\tCategory/’
  > result/picrust/${l}.anno.txt

差异比较

compare=“KO-WT”
Rscript $db/script/compare.R--inputresult/picrust/${l}.mat.txt --design result/metadata.txt
  --group Group --compare ${compare} --threshold 0
  --method wilcox --pvalue 0.05 --fdr 0.2
  --output result/picrust/

可对结果${compare}.txt筛选

绘制指定组(A/B)的柱状图，按高分类级着色和分面

Rscript $db/script/compar{e}_{h}ierarch{y}_{f}acet.R--inputresult/picrust/${compare}.txt
  --data MeanA
  --annotation result/picrust/$l.anno.txt--outputresult/picrust/${compare}.MeanA.bar.pdf

绘制两组显著差异柱状图，按高分类级分面

Rscript $db/script/compar{e}_{h}ierarch{y}_{f}acet2.R--inputresult/picrust/${compare}.txt
  --pvalue 0.05 --fdr 0.1
  --annotation result/picrust/$l.anno.txt--outputresult/picrust/${compare}.bar.pdf

 ### PICRUSt 2.0

软件安装见附录6. PICRUSt环境导出和导入

(可选)PICRUSt2(Linux/Windows下Linux子系统，要求>16GB内存)

安装参考附录5的方式直接下载安装包并解压即可使用

Linux中加载conda环境

conda activate picrust2

进入工作目录，服务器要修改工作目录

wd=/mnt/d/amplicon/result/picrust2
mkdir -p ${wd} && cd ${wd}

运行流程，内存15.7GB，耗时12m

picrust2_pipeline.py -s …/otus.fa -i …/otutab.txt -o ./out -p 8

添加EC/KO/Pathway注释

cd out
add_descriptions.py -i pathways_out/path_abun_unstrat.tsv.gz -m METACYC
  -o METACYC.tsv
add_descriptions.py -i EC_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat.tsv.gz -m EC
  -o EC.tsv
add_descriptions.py -i KO_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat.tsv.gz -m KO
  -o KO.tsv

KEGG按层级合并

db=/mnt/d/EasyMicrobiome/
python3 ${db}/script/summarizeAbundance.py
  -i KO.tsv
    -m ${db}/kegg/KO1-4.txt
    -c 2,3,4 -s ‘,+,+,’ -n raw
    -o KEGG

统计各层级特征数量

wc -l KEGG*

可视化见picrust2文件夹中ggpicrust2.Rmd

##### 元素循环FAPROTAX

方法1. 在线分析，推荐使用 http://www.bic.ac.cn/ImageGP/index.php/Home/Index/FAPROTAX.html 在线分析

方法2. Linux下分析、如QIIME 2环境下

设置工作目录

wd=/mnt/d/amplicon/result/faprotax/
mkdir -p ${wd} && cd ${wd}

设置脚本目录

sd=/mnt/d/EasyMicrobiome/script/FAPROTAX_1.2.7

1. 软件安装

注：软件已经下载至 EasyMicrobiome/script目录，在qiime2环境下运行可满足依赖关系

#(可选)下载软件新版本，以1.2.7版为例， 2023/7/14更新数据库
#wget -c https://pages.uoregon.edu/slouca/LoucaLab/archive/FAPROTAX/SECTION_Download/MODULE_Downloads/CLASS_Latest%20release/UNIT_FAPROTAX_1.2.7/FAPROTAX_1.2.7.zip
#解压
#unzip FAPROTAX_1.2.7.zip
#新建一个python3环境并配置依赖关系，或进入qiime2 python3环境
conda activate qiime2-2023.7

source /home/silico_biotech/miniconda3/envs/qiime2/bin/activate

#测试是否可运行，弹出帮助即正常工作
python $sd/collapse_table.py

2. 制作输入OTU表

#txt转换为biom json格式
biom convert -i …/otutab_rare.txt -o otutab_rare.biom --table-type=“OTU table” --to-json
#添加物种注释
biom add-metadata -i otutab_rare.biom --observation-metadata-fp …/taxonomy2.txt
  -o otutab_rare_tax.biom --sc-separated taxonomy
  --observation-header OTUID,taxonomy
#指定输入文件、物种注释、输出文件、注释列名、属性列名

3. FAPROTAX功能预测

#python运行collapse_table.py脚本、输入带有物种注释OTU表tax.biom、
#-g指定数据库位置，物种注释列名，输出过程信息，强制覆盖结果，结果文件和细节
#下载faprotax.txt，配合实验设计可进行统计分析
#faprotax_report.txt查看每个类别中具体来源哪些OTUs
python ${sd}/collapse_table.py -i otutab_rare_tax.biom
  -g ${sd}/FAPROTAX.txt
  --collapse_by_metadata ‘taxonomy’ -v --force
  -o faprotax.txt -r faprotax_report.txt

4. 制作OTU对应功能注释有无矩阵

对ASV(OTU)注释行，及前一行标题进行筛选

grep ‘ASV_’ -B 1 faprotax_report.txt | grep -v -P ‘^–$’ > faprotax_report.clean

faprotax_report_sum.pl脚本将数据整理为表格，位于public/scrit中

perl ${sd}/…/faprotax_report_sum.pl -i faprotax_report.clean -o faprotax_report

查看功能有无矩阵，-S不换行

less -S faprotax_report.mat

##### Bugbase细菌表型预测

1. Bugbase命令行分析

cd $wd/resultbugbase=${db}/script/BugBase
rm -rf bugbase/

脚本已经优化适合R4.0，biom包更新为biomformat

Rscript ${bugbase}/bin/run.bugbase.r -L ${bugbase}
  -i gg/otutab.txt -m metadata.txt -c Group -o bugbase/

2. 其它可用分析

使用 http://www.bic.ac.cn/ImageGP/index.php/Home/Index/BugBase.html

官网，https://bugbase.cs.umn.edu/ ，有报错，不推荐

Bugbase细菌表型预测Linux，详见附录3. Bugbase细菌表型预测

##### MachineLearning机器学习

RandomForest包使用的R代码见advanced/RandomForestClassification和RandomForestRegression

Silme2随机森林/Adaboost使用代码见EasyMicrobiome/script/slime2目录中的slime2.py，详见附录4

使用实战(使用QIIME 2的Python3环境，以在Windows中为例)

conda activate qiime2-2023.7
cd /mnt/d/EasyMicrobiome/script/slime2
#使用adaboost计算10000次(16.7s)，推荐千万次
./slime2.py otutab.txt design.txt --normalize --tag ab_e4 ab -n 10000
#使用RandomForest计算10000次(14.5s)，推荐百万次，支持多线程
./slime2.py otutab.txt design.txt --normalize --tag rf_e4 rf -n 10000

####  Evolution进化树

cd ${wd}
mkdir -p result/tree
cd ${wd}/result/tree

1. 筛选高丰度/指定的特征

#方法1. 按丰度筛选特征，一般选0.001或0.005，且OTU数量在30-150个范围内
#统计特征表中ASV数量，如总计1609个
tail -n+2 …/otutab_rare.txt | wc -l
#按相对丰度0.2%筛选高丰度OTU
usearch -otutab_trim …/otutab_rare.txt
    -min_otu_freq 0.002
    -output otutab.txt
#统计筛选OTU表特征数量，总计~81个
tail -n+2 otutab.txt | wc -l

#方法2. 按数量筛选

#按丰度排序，默认由大到小

usearch -otutab_sortotus …/otutab_rare.txt  \

-output otutab_sort.txt

#提取高丰度中指定Top数量的OTU ID，如Top100,

sed ‘1 s/#OTU ID/OTUID/’ otutab_sort.txt \

| head -n101 > otutab.txt

#修改特征ID列名
sed -i ‘1 s/#OTU ID/OTUID/’ otutab.txt
#提取ID用于提取序列
cut -f 1 otutab.txt > otutab_high.id

筛选高丰度菌/指定差异菌对应OTU序列

usearch -fastx_getseqs …/otus.fa -labels otutab_high.id
    -fastaout otus.fa
head -n 2 otus.fa

筛选OTU对物种注释

awk ‘NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print a[$1]}’ …/taxonomy.txt
    otutab_high.id > otutab_high.tax

#获得OTU对应组均值，用于样本热图
#依赖之前otu_mean.R计算过按Group分组的均值
awk ‘NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print a[$1]}’ …/otutab_mean.txt otutab_high.id
    | sed ‘s/#OTU ID/OTUID/’ > otutab_high.mean
head -n3 otutab_high.mean

#合并物种注释和丰度为注释文件
cut -f 2- otutab_high.mean > temp
paste otutab_high.tax temp > annotation.txt
head -n 3 annotation.txt

2. 构建进化树

起始文件为 result/tree目录中 otus.fa(序列)、annotation.txt(物种和相对丰度)文件

Muscle软件进行序列对齐，3s

muscle -in otus.fa -out otus_aligned.fas

方法1. 利用IQ-TREE快速构建ML进化树，2m

rm -rf iqtree
mkdir -p iqtree
iqtree -s otus_aligned.fas
    -bb 1000 -redo -alrt 1000 -nt AUTO
    -pre iqtree/otus

方法2. FastTree快速建树(Linux)

注意FastTree软件输入文件为fasta格式的文件，而不是通常用的Phylip格式。输出文件是Newick格式。

该方法适合于大数据，例如几百个OTUs的系统发育树！

Ubuntu上安装fasttree可以使用apt install fasttree

fasttree -gtr -nt otus_aligned.fas > otus.nwk

3. 进化树美化

访问http://itol.embl.de/，上传otus.nwk，再拖拽下方生成的注释方案于树上即美化

方案1. 外圈颜色、形状分类和丰度方案

annotation.txt OTU对应物种注释和丰度，

-a 找不到输入列将终止运行（默认不执行）-c 将整数列转换为factor或具有小数点的数字，-t 偏离提示标签时转换ID列，-w 颜色带，区域宽度等， -D输出目录，-i OTU列名，-l OTU显示名称如种/属/科名，

cd ${wd}/result/tree

Rscript ${db}/script/table2itol.R -a -c double -D plan1 -i OTUID -l Genus -t %s -w 0.5 annotation.txt

生成注释文件中每列为单独一个文件

方案2. 生成丰度柱形图注释文件

Rscript ${db}/script/table2itol.R -a -d -c none -D plan2 -b Phylum -i OTUID -l Genus -t %s -w 0.5 annotation.txt

方案3. 生成热图注释文件

Rscript ${db}/script/table2itol.R -c keep -D plan3 -i OTUID -t %s otutab.txt

方案4. 将整数转化成因子生成注释文件

Rscript ${db}/script/table2itol.R -a -c factor -D plan4 -i OTUID -l Genus -t %s -w 0 annotation.txt

树iqtree/otus.contree在 http://itol.embl.de/ 上展示，拖拽不同Plan中的文件添加树注释

返回工作目录

cd ${wd}

4. 进化树可视化

https://www.bic.ac.cn/BIC/#/ 提供了更简易的可视化方式

附加视频

目录 Supp，网课有对应视频(可能编号不同，找关键字)

S1. 网络分析R/CytoGephi

目录 Supp/S1NetWork

S2. 溯源和马尔可夫链

目录 Supp/S2SourcetrackerFeastMarkov

S11、网络分析ggClusterNet

代码：advanced/ggClusterNet/Practice.Rmd

S12、Microeco包数据可视化

代码：advanced/microeco/Practice.Rmd

##  附录：Linux服务器下分析(选学)

#注：Windows下可能无法运行以下代码，推荐在Linux，或Windows下Linux子系统下conda安装相关程序

1. LEfSe分析

mkdir -p ~/amplicon/lefse
cd ~/amplicon/lefse

format2lefse.Rmd代码制作或上传输入文件LEfSe.txt

安装lefse

conda install lefse

#格式转换为lefse内部格式
lefse-format_input.py LEfSe.txt input.in -c 1 -o 1000000
#运行lefse
run_lefse.py input.in input.res
#绘制物种树注释差异
lefse-plot_cladogram.py input.res cladogram.pdf --format pdf
#绘制所有差异features柱状图
lefse-plot_res.py input.res res.pdf --format pdf
#绘制单个features柱状图(同STAMP中barplot)
head input.res #查看差异features列表
lefse-plot_features.py -f one --feature_name “Bacteria.Firmicutes.Bacilli.Bacillales.Planococcaceae.Paenisporosarcina”
   --format pdf input.in input.res Bacilli.pdf
#批量绘制所有差异features柱状图，慎用(几百张差异结果柱状图阅读也很困难)
mkdir -p features
lefse-plot_features.py -f diff --archive none --format pdf
  input.in input.res features/

2. PICRUSt功能预测

#推荐使用 http://www.bic.ac.cn/BIC/#/analysis?tool_type=tool&page=b%27Mzk%3D%27 在线分析
#有Linux服务器用户可参考以下代码搭建本地流程

n=picrust
conda create -n ${n} ${n} -c bioconda -y

wd=/mnt/d/amplicon
cd $wd/result/gg

启动环境

conda activate picrust
#上传gg/otutab.txt至当前目录
#转换为OTU表通用格式，方便下游分析和统计
biom convert -i otutab.txt
    -o otutab.biom
    --table-type=“OTU table” --to-json

设置数据库目录，如 /mnt/d/db

db=~/db
#校正拷贝数，30s, 102M
normalize_by_copy_number.py -i otutab.biom
    -o otutab_norm.biom
    -c ${db}/picrust/16S_13_5_precalculated.tab.gz
#预测宏基因组KO表，3m,1.5G，biom方便下游归类，txt方便查看分析
predict_metagenomes.py -i otutab_norm.biom
    -o ko.biom
    -c ${db}/picrust/ko_13_5_precalculated.tab.gz
predict_metagenomes.py -f -i otutab_norm.biom
    -o ko.txt
    -c ${db}/picrust/ko_13_5_precalculated.tab.gz

#按功能级别分类汇总, -c输出KEGG_Pathways，分1-3级
sed  -i ‘/# Constru/d;s/#OTU //’ ko.txt
num=head -n1 ko.txt|wc -w
paste <(cut -f $numko.txt)<(cut-f1-$[num-1] ko.txt) > ko.spf
for i in 1 2 3;do
  categorize_by_function.py -f -i ko.biom -c KEGG_Pathways -l $i-opathway${i}.txt
  sed  -i ‘/# Const/d;s/#OTU //’ pathway${i}.txt
  paste <(cut -f $numpathway${i}.txt) <(cut -f 1-$[num-1]pathway${i}.txt) > pathway${i}.spf
done
wc -l *.spf

3. Bugbase细菌表型预测

1. 软件安装(己整合到EasyMicrobiome中，原代码需要更新才能在当前运行)

#有两种方法可选，推荐第一种，可选第二种，仅需运行一次

#方法1. git下载，需要有git

git clone https://github.com/knights-lab/BugBase

#方法2. 下载并解压

wget -c https://github.com/knights-lab/BugBase/archive/master.zip

mv master.zip BugBase.zip

unzip BugBase.zip

mv BugBase-master/ BugBase

cd BugBase
#安装依赖包
export BUGBASE_PATH=pwd
export PATH=$PATH:pwd/bin
#安装了所有依赖包
run.bugbase.r -h
#测试数据
run.bugbase.r -i doc/data/HMP_s15.txt -m doc/data/HMP_map.txt -c HMPBODYSUBSITE -o output

2. 准备输入文件

cd ~/amplicon/result
#输入文件：基于greengene OTU表的biom格式(本地分析支持txt格式无需转换)和mapping file(metadata.txt首行添加#)
#上传实验设计+刚才生成的otutab_gg.txt
#生成在线分析使用的biom1.0格式
biom convert -i gg/otutab.txt -o otutab_gg.biom --table-type=“OTU table” --to-json

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