激光拉曼光谱仪检测生命物质的应用-科学指南针

1.引言

自从60年代发明激光技术以来,激光器械及其在各种领域的应用取得了突飞猛进的发展，逐步成为一门应用十分广泛的科学技术，在生命物质检测方面也有着极其广阔的发展前景。

激光之所以发展快、应用广、影响深，最主要的原因是激光具有普通光所无法比拟的优异特性，如亮度极高，方向性、单色性、相干性极好等。就生物体而言，激光的能量被生物组织吸收后，会产生一系列的生物效应，包括热效应、光化学效应、压强效应、电磁效应及生物刺激效应等多种。在基础理论方面，国外注意新的激光器的生物学效应研究，如锁模激光器、准分子激光器、高功率激光器等对人体各组织器官的影响。还利用电子显微镜电子计算机、荧光染色技术等深入研究激光生物效应。

国内从1965年起进行激光医学的基础理论研究，近年来进行了动物肝受Nd：YAG激光照射后的超微结构的研究，红宝石激光微束照射培养癌细胞分裂期结构的研究,激光微米束对微核仁的影响,N分子激光对培养肿瘤细胞的效应,激光和Nd：YAG激光在生物组织中的热传导等, 同时还对激光是否能引起染色体畸变作了初步探索。

2.拉曼光谱的基本原理

2.1瑞利线与拉曼线
在散射光谱中，瑞利线最易观察，其频率等于入射光频率，其强度大，表现为十分尖锐的瑞利峰。另外，在瑞利峰的两侧还可以看到强度比瑞利线低很多频率分别为的散射线，瑞利峰与拉曼线的频率之差叫拉曼位移是散射物质的特征量，可用于物质的定性测定。拉曼线在瑞利线两侧成对出现，在瑞利峰低频侧的拉曼线叫斯托克斯线，又叫红伴线；在瑞利峰高频侧的拉曼线叫反斯托克斯线，又叫紫伴线。因反斯托克斯线的强度比斯托克斯线弱很多，故一般用斯托克斯线进行样品的拉曼分析。

量子理论认为，光散射是在光量子与物质分子的碰撞过程中形成的。发生弹性碰撞时，光量子与分子间无能量交换，故散射光频率等于入射光频率，这就是瑞利散射；发生非弹性碰撞时，光量子与分子间有能量交换，故散射光频率发生位移，形成拉曼散射。如入射光的照射使处于振动基态的分子或原子激发到较高振动能态上而损失能量时，则入射光子能量下降，使散射光频率减小而形成红伴线；如入射光的照射使处于较高振动能态的分子或原子失活，返回振动基态而获得能量时，则入射光子能量上升，使散射光频率增升而形成紫伴线。由于平时处于振动基态的分子远较处于激发态为多，故斯托克斯线的强度较反斯托克斯线的强度为大。

2.2拉曼散射光的退偏振作用
经典理论认为，入射光的电磁波与被照射物质分子，原子相互作用时，使其正负电荷中心发生移动，产生极化，形成感生偶极子，感生偶极子所辐射的电磁波就是散射光波。极化所形成的偶极矩的大小与入射光子的电场分量E及极化率有关，有：

如分子被各向同性的极化，则散射光使线偏振光；如分子被各向异性的极化（拉曼散射时），则散射光就不是完全的线偏振光，而是部分的退偏振，这就是拉曼散射光的退偏振作用。退偏振度的定义是：

式中和分别是垂直于和平行于入射光方向的散射光强度。退偏度可以实际测量，它反映被照射物质分子的振动类型，属于完全对称振动亦或不完全对称振动。

3.线性拉曼光谱和非线性拉曼光谱
拉曼光谱包括线性拉曼光谱和非线性拉曼光谱，线性拉曼光谱包括共振拉曼光谱，电子拉曼光谱和旋光拉曼光谱，非线性拉曼光谱包括受激拉曼光谱，逆拉曼光谱，超拉曼光谱和相干拉曼光谱等。线性拉曼光谱在激光出现前就已经观测到，但非线性拉曼光谱只开始于激光出现以后，属于强光激发的拉曼光谱。

3.1线性拉曼光谱
共振拉曼光谱是分子的振动跃迁和电子跃迁的迭加，因生色团中价电子的跃迁所需激发能量一般较低，故在振动跃迁的同时可发生电子跃迁而形成共振拉曼光谱。含生色团的生物分子，如蛋白质、核酸和维生素等均可以产生共振拉曼光谱，可对这些基因进行定性测定。电子拉曼光谱是当激发光能量等于相应两个电子能级差时发生的，在普通物质中，因电子能级间距大，因而所需激发光能量大而不易观察到电子拉曼散射，目前只在单晶中的稀土离子及过渡金属中看到这种光谱，而这些元素在生物体中均有存在。旋光拉曼效应是指左旋和右旋圆偏振的激光所引起的拉曼散射光的强度不同，此效应可用于样品分子中是否含有镜像对称结构的探查。

3.2非线性拉曼光谱
提高激光功率，在一定条件下使拉曼散射光具有激光的某些性质，如亮度大，方向性强等，这叫受激拉曼散射。受激拉曼散射只在当入射光功率超过某一阈值时才能发生，故属于非线性拉曼光谱，而一般的线性拉曼光谱可在任何光强的照射下产生，无阈值存在。逆拉曼散射是产生拉曼散射的逆过程，物质分子吸收了能量较高的反斯托克斯线的能量，同时发射入射光谱率的光子，这一光谱可用于短寿命自由基的分析，一般拉曼散射是指吸收一个光子，发射一个光子的过程，属于双光子过程；而超拉曼散射则是吸收两个光子，发射一个光子的过程，属于三光子过程。相干拉曼散射是一种类似于激光的相干辐射，一般的拉曼散射只使用一个激发光源，散射光可向任何方向发射，而相干拉曼散射却使用两个激发光源，如二光源所发射的光。存在一定的位相差而相干时，则散射光只沿一定方向发射，这使相干拉曼散射光的收集效率大大提高，可用于激光诊断，光化学动力学及能量的弛豫和转换过程的研究。

4.几种常见的分析方法及其应用4.1常规激光拉曼光谱分析
常规激光拉曼对 DNA 的分析主要考虑其构型构像的变化、碱基的损伤、氢键的断裂以及单双链的断裂等。以下是几种有关常规激光拉曼光谱的研究。

4.1.1　纤维态和水溶液状态 DNA 结构研究
双链DNA分子在水溶液中呈 B型，纤维态多半呈 A 型。余多慰等发现水溶液中DNA的空间构像虽然以B型为主，但同时存在A型构像。鲱精 DNA与小牛胸腺 DNA、鲑精 DNA 具有同样的水合状态，每核苷酸对含有 9 个～14个结合水分子[1]。Benevides用拉曼光谱比较了d (CGCGTG) 和d (CGCGCG)的晶体结构。发现碱基 G·T 的失配对 Z-DNA 的构型没有明显的影响,两种晶体的结构仍为Z 型的C3′型-dG 和C2′型-dG。d (CGCGTG) 和 d ( CGCGCG) 在水溶液中都显示为 B 型 DNA 结构，但差异明显。d (CGCGTG) 中的10个 OPO 基团只有 6个是 B 型，其余的4个具有不平常的B型结构[2]。d(GGG ATCCC)2晶体一般形成 A 型 DNA 双螺旋，某些小片段可能是B型构像，但其水溶液中出现了 B型 DNA 结构,因此八聚体是类似 B 型的构像[3]。Poon 等用拉曼光谱检测 Tel、TG等寡聚核苷酸组成的多链 DNA 时，发现Tel和TG聚合物具有相似的结构，大部分的碱基是C2′内型反式构像。但两种复合物的骨架构型不同，TG比 Tel 复合物的骨架结构更稳定[4]。T Miura 等用拉曼谱研究了端粒 DNA的溶液二级结构和核苷构像，发现单链和双链端粒DNA 都显示了结构的多态性，其B型DNA中双螺旋是不均匀的[5]。DNA 的超螺旋在基因组的复制、重组、翻译、修饰和浓缩中非常重要。Serban 等对超螺旋和线性质粒的拉曼谱进行了比较，发现它们的拉曼谱差异虽然较小，但非常明显，它们的骨架构像不完全一致，超螺旋中B型DNA规范的C2′构像因超螺旋的诱导而发生了变化[6]。

4.1.2 酸碱变性、热变性及光或射线诱变DNA研究
酸碱变性是诱导 DNA 结构变化的重要因素。DNA经36%醋酸处理后，其分子内部发生明显的质子化作用，部分GC之间形成 Hoogsteen 碱基配对，酸不仅导致了部分嘌呤的脱落还导致了部分嘧啶的脱落，且嘧啶的质子化可能强于嘌呤；质子化、脱嘌呤、脱嘧啶的共同作用进一步引起氢键的断裂，使DNA分子内双链状态不稳定；酸诱导DNA时发生了酸变性，但其产物性质显著不同于热变性或碱变性产物[7]。热变性也可以导致DNA结构发生变化，从而改变其一系列物理化学性质，影响其遗传、复制等生物学功能。Duguid等发现 B 型双链DNA在热变性时伴随着沃森-克里克碱基对的分裂、碱基的解堆积和B型构像骨架的无序化[8]。王杰芳等则观察到热变性导致DNA构型发生变化时，DNA双螺旋结构遭到破坏，碱基之间氢键断裂以及垂直的碱基，碱基堆积相互作用被破坏[9]。DNA损伤与基因突变是紫外线致癌的重要机制。紫外辐射会严重影响DNA的构象，损伤碱基间的氢键和基团，使DNA产生不可逆的变性。一般认为人类皮肤癌主要与UVB (紫外线B区) 暴露有关。研究显示UVA和UVB 辐射对 DNA 的影响远比 UVC 照射小，但大剂量UVA长期照射也可以引起皮肤肿瘤，并且UVA照射可能促进UVB 诱发肿瘤的形成[10]。相比紫外线γ射线对DNA的损伤更加严重。DNA 受γ射线,照射后，氢键断裂，碱基受损，主链断裂，超螺旋结构解旋，遗传信息丢失，以致失去转录、复制等生物学功能[11]。激光也能产生致癌作用，它能导致基因突变，改变细胞遗传物质的特性。张淑辉等通过实验说明了He-Ne 激光可诱变DNA构型 (A型→B 型)，使碱基发生互变异构。

4.1.3 金属离子、金属配合物及药物分子与DNA 相互作用的研究
生物活性和生命活动都离不开金属离子的存在，金属离子可稳定核酸的结构，对核酸有特定的键合作用，有些还能直接与 DNA 配位。但金属离子也会对DNA结构产生损伤。拉曼光谱研究发现金属离子和 DNA相互作用时影响 DNA的构像，使 DNA双螺旋发生变性。其中过渡金属离子对B 型DNA的构像改变作用最大，对DNA磷酸盐的影响要弱，而碱土金属对碱基和磷酸盐都没有大的影响。二价金属离子对DNA结构的破坏还与分子量大小有关。沈鹤柏等用光谱法研究铕离子和铈离子等七种稀土金属离子对DNA的作用时，则发现一些稀土金属离子不仅能使DNA的构型发生变化 ,而且具有切断DNA 主链的磷酸二酯键的作用。实验结果为探索新的DNA水解切断体系及了解稀土元素进入人体后的作用机制提供了有价值的依据。氯化钠浓度增加时，DNA 的嘧啶残基从 C2′型向 C3′型转变。而且 DNA 结构的变化还与 DNA的浓度有关，DNA 浓度较高时结构变化较大。但是只在天然 DNA 的确定部位发生右手构像向左手构像的转变。Wartel 等发现 浓度增加时1572bp片段发生B到Z型的构像变化，4.5M时(dC-dG) 片段是 Z 型构像，95bp区的碱基堆积仍保持B型构像，但是这个区的相当一部分不再保持B型骨架。但也有研究发现，一定浓度范围内的增加并不改变核苷酸的B型构像。而Mn在低水活性时，少量的(镍离子) 就能诱导出DNA 的z型构像。Kornilova等发现DNA与复合时A型构型发生改变，每单位核苷的水合容量增大。离子在相对湿度50%~76%之间降低生物聚合物的水合作用，从而对 DNA与离子的相互作用产生影响。糖苷键附近的碱基扭转角也发生了变化，变得与顺式构像相符。Neault 等观察了pH值7.6时水溶液DNA 和抗坏血酸维生素C的相互作用。他们对药物的结合位点、序列特性 DNA 构像的变化、熔融特性以及水溶液中药物 DNA复合物结构进行了分析，发现大沟和小沟中A-T碱基和G碱基都发生了变化，DNA 螺旋变得轻微地不稳定。抗坏血酸主要是通过OH的氢键和C-O基团与磷酸盐、碱基及脱氧核酸供体原子发生相互作用。

4.1.4 酶和蛋白质等生物分子与 DNA 的相互作用研究
酶是活细胞中的生物催化剂，能催化细胞或生物体进行新陈代谢及各种化学反应。研究发现酶能诱导DNA发生扭曲，这可能就是DNA与酶的相互作用的本性。Rosenberg 等用α小体时，观察到核心DNA 的B型构像向中间B型或A型构像转变，发现短暂的糜蛋白酶处理对DNA的损伤是不可恢复的。Benevides 等发现蛋白质能诱导 DNA 发生弯曲，为此提出了一个控制基因表达的DNA 重组模型，并且认为人类性别转换可能与DNA 的变化有关。精胺和亚精胺既能结合、浓缩基因组 B-DNA 而又不破坏其天然结构。在四组包含不同比率 GC 碱基对的 DNA 基因组与亚精胺和精胺相互作用时，HongDeng 等人发现：B-DNA 的磷酸盐是相互作用的主要标靶；磷酸盐的结构变化符合非特异性阳离子结合模型，聚胺的结合作用对天然DNA的B-构型的影响几乎可以忽略。Hud 等为精胺与 DNA 的聚合物二级结构提出了一种新的模型。他们在研究相对湿度98%条件下鱼精蛋白和DNA 的固态复合物时，发现复合物中 DNA 的B型构像受到了修饰，氢键也发生了变化。多精胺虽然与鱼精胺有相似的主结构，但它们与 DNA 结合时所采取的构像却完全不同。单链 DNA与抗菌素Ff蛋白 (gVp) 结合时，螺旋骨架结构、碱基堆积和磷酸二酯骨架构像都只发生了细微的变化。而当gVp与特定序列双链DNA结合时，却导致DNA 结构明显改变。

4.2 激光共振拉曼光谱分析
激光共振拉曼光谱(RSS)产生激光频率与待测分子的某个电子吸收峰接近或重合时，这一分子的拉曼线强度可增强~倍，并能观察到强度可与基频相比拟的泛频及组合振动光谱。与正常拉曼光谱相比，激光共振拉曼光谱具有灵敏度高、所需样品(~)浓度低反映结构信息量大等特点。由于核酸的电子吸收带在 260 nm~280 nm，因此，还可以选择性地共振激发核酸色团来研究药物与核酸作用的精确位置。

4.2.1 抗癌药物等物质与DNA作用研究
DNA是许多抗癌药物作用的标靶，药物与DNA相互作用使DNA受到损伤。用共振拉曼光谱研究抗癌药物与DNA的相互作用，能够得出相互作用的位点和连接方式等重要信息，为药物的定向合成提供理论依据。药物分子主要是通过插入、沟槽连接或共价键连接三种基本方式与DNA 结合在一起，并凭借氢键和库仑力使相互作用加强。大多数抗癌药物通过插入或沟槽连接与DNA相互作用，与DNA共价键连接的抗癌药物则较少。水溶金属卟啉是一种很好的抗癌模型化合物。赵晓杰等研究了卟啉类光敏剂与DNA的相互作用机理，并对卟啉类光敏剂对癌症的定位和光动力学疗法进行了探讨。他们发现 :只有铜卟啉能与DNA形成激发态复合物；水溶卟啉是以沟槽连接与DNA作用；卟啉与DNA作用后吡啶基团向垂直卟啉环平面方向转过一个小的角度；在 445 nm 脉冲激光激发下,卟啉易于与DNA形成电子激发态复合物。Wheeler 等在研究多聚核苷酸及小牛胸腺DNA (ctDNA) 与铜卟啉的相互作用时，提出了两种不同的铜卟啉和核酸的结合外部结合模式。当继续增加铜卟啉时，核苷酸的 B型结构会进一步发生改变。典型的插入类抗癌药物阿霉素 (ADM) 和阿克拉霉素(ACM)与ctDNA 的相互作用时，DNA构像和DNA碱基间的氢键均受到显著影响。ctDNA 和阿霉素形成水溶液态复合物，复合物中阿霉素生色团插入到 GC 序列中。在此插入作用中除了π-π相互作用、羟基相互作用和氨基相互作用外，还包含了生色团酚基团的相互作用 ADM 插入 DNA 虽然使其构像发生一定的变化，但并未破坏 DNA 碱基对间的氢键。喜树碱 (CPT)及其衍生物 (CPT11)都对核苷酸的结构有影响，不过CPT11与寡聚核苷的作用比CPT要弱得多且与CPT作用方式不同。如果 CPT11和寡聚核苷酸CPT形成易劈裂的三重复合物，则相互作用得到增强 DNA 拓扑异构酶I能改变CPT和寡聚核苷酸的分子相互作用。四肽 (SPKK)与多聚核苷相结合时能够减弱多聚核苷碱基对间氢键作用和碱基堆积相互作用，使DNA的双螺旋结构变得不稳定，但多聚核苷酸的结构并不因 SPKK 而改变。SPKK 对 DNA 的修饰作用虽然在一定程度上解散了DNA的双螺旋结构，但同时增加了DNA 的灵活性，从而使之更容易形成染色体。

4.2.2 病毒中DNA研究
ZQ Wen 等[12]用紫外拉曼共振谱研究了病毒包裹的单链 DNA，得到了基因组 dA,dC,dG和dT 残基的特征谱。他们发现:257nm的单链(ss) DNA 基因组的拉曼峰得到选择性增强，包裹使单链 DNA 碱基的拉曼谱出现减色;fd基因组的DNA 核苷酸趋向于采取低能量结构的 C3′式构像而不是 C2′的 DNA 中不同的脱氧核苷糖环构像和碱基堆积及二者胸腺嘧啶羰基的氢键相互作用时,发现两种聚合物中单链DNA基因组的结构基本上是不一样的。

4.3 表面增强拉曼光谱分析
常规拉曼散射散射截面小，灵敏度低，只能对一定纯度和浓度的样品进行分析。但是当化合物吸附或者接近一个特殊的导电表面时，拉曼散射截面增强约倍，加之活性载体表面选择吸附分子对荧光发射的抑制,使激光拉曼光谱分析的信噪比大大提高，这样就可以用来研究稀释的生物样品。这种技术称为表面增强拉曼光谱 (SERS) 技术。表面增强拉曼光谱技术可以在分子水平上研究被散射物质分子的结构信息，并且能有效地消除荧光干扰,其短程增强特性在 DNA的复合物拓扑结构研究中有独特优势。

4.3.1抗癌药物与DNA相互作用研究
叶勇等[13]用表面增强拉曼光谱技术研究了4种D-氨基葡萄糖配合物与 DNA 的相互作用及其抗癌活性.他们发现这4种配合物在银胶上的吸附方式基本相同， 但与DNA 的作用能力有很大的不同。CuGluG与DNA的结合能力较强，发生了类似溴化CuG乙啶的插入作用，其余化合物插入作用较弱。Co的混配配合物 Co (Ⅲ) GluG 也能与 DNA 发生作用，但并不是插入作用。其中CuGluG、(Ⅲ) GluG是值得Co进一步研究的可能的抗癌药物。他们还发现席夫碱类化合物多数具有一定的抗癌活性，形成金属配合物后抗癌活性更佳。抗癌药物分子多与 DNA形成沟槽连接，化合物2-CACo 则与 DNA 发生了插入作用，而2-CAZn与DNA可能发生了键合作用，作用位点为磷酸氧。喜树碱水溶性衍生物 Topote-can ( TPT) 是一种针对DNA 拓扑异构酶I (top1)的抗肿瘤药物，能够稳定 DNA 和酶的复合物。表面增强拉曼谱显示 TPT 对DNA 和top1 的相互识别具有调控作用，TPT 的存在使 DNA 和 top1的结合增加 3 到5倍。溶液中TPT二聚物能够把不同的DNA分子或同一分子的不同区域结合起来，这种效应促进了对DNA结构的修饰，导致top1新结合位点的出现。

4.3.2药物等小分子与DNA的作用研究
从分子水平上研究药物等小分子和DNA 的相互作用，有助于阐明分子对核酸的复制和转录的影响及相互作用机制，对于理解疾病的起源、中药的治病机理、药物筛选和设计新药具有重要意义。王树玲等用表面增强拉曼光谱研究了小檗碱 (BER)与小牛胸腺 DNA 的相互作用，发现小檗碱分子的异喹啉部分可能键合到 DNA 的小沟槽，小檗碱与 DNA 的相互作用模式主要是通过静电力及疏水相互作用而形成的沟槽键合。董丽琴等研究钴邻菲口罗啉配合物离子与DNA的相互作用时，发现药物与双链DNA存在一定的嵌插作用，而与单链DNA则以静电模式结合。他们的研究成果为寻找抗肿瘤和抗病毒药物研究提供了理论和物质基础。

4.3.3基因芯片相关DNA研究
随着人类基因组计划的顺利实施，基因芯片研究正成为基因组研究的一个热点。DNA 在基体上的固定化和杂交效率的提高以及杂交信号的检测是基因芯片技术进一步完善的关键，而从分子水平上了解 DNA 在金属/ 溶液界面的吸附取向则是基因芯片研究的基础。杨海峰等利用原位表面增强拉曼光谱电化学技术研究了 DNA 理论水解产物之一腺苷在银电极上吸附行为，发现腺苷的腺嘌呤部分在电极上是平躺构型。生物分子5-腺苷磷酸 (AMP)和 DNA 在银溶胶中的增强拉曼光谱显示 AMP在银溶胶中可能是腺嘌呤吸附在胶粒界面上，而在 DNA分子中则是处于外部的核糖或磷酸基与银溶胶中的胶粒发生了吸附。A.Mara。等用荧光光谱和表面增强拉曼谱研究了药物9-氨基吖啶 (9AA)和 DNA及右旋糖苷硫酸盐的相互作用。他们发现9AA与磷酸盐的静电相互作用对复合物的形成至关重要，磷酸盐基团所带负电荷诱导药物接近 DNA 链，使得聚合物附近的药物浓度增加，从而增强反应效果。但复合物中DNA仍然保持B型结构。复合物荧光发射则可能是由药物和 DNA 序列之间的电荷转移引起的。

4.4傅立叶变换拉曼光谱分析
传统拉曼光谱技术信号弱，灵敏度低，且易受荧光干扰，应用范围受到限制。傅立叶变换拉曼光谱采用傅立叶变换技术对信号进行收集，多次累加来提高信噪比，并用1064mm的近红外激光照射样品，大大减弱了荧光背景。因此，傅立叶变换拉曼光谱技术在化学、生物学和生物医学样品的非破坏性结构分析方面已经显示出了巨大的生命力。傅立叶变换拉曼光谱对DNA的研究主要集中在 DNA 结构、DNA 的吸附、射线诱变及药物与DNA的相互作用等方面。方晔等用傅立叶变换拉曼光谱研究溶液状态下三链DNA·与双链DNA ·的构像时发现:三螺旋DNA同时存在C3′内褶，反对称（A型)和 C2′内褶，反对称（B型）两种构想，同时还存在在一种处于A和B构型之间的中间构型； 双螺旋DNA 在溶液中则以A和B两种构型共存。Sailer等研究了电离辐射诱导的水溶液中双链 DNA 的结构变化。他们发现除了碱基损伤、链的断裂和结构变换以外，还存在碱基的解堆积、预熔化效应和 B型骨架的无序化。DNA 的损伤取决于γ射线的剂量和 DNA 的浓度，其中 DNA 的 B 型构像减少并且有新的二级结构出现。阿司匹林在止痛和治疗心脏病上有特定功效。Neault 等用傅立叶变换红外拉曼谱研究阿司匹林与 DNA 的相互作用，并以之来确定药物的结合位点、序列偏好、DNA 的二级结构以及水溶液中复合物的结构变化。实验发现药物能使DNA从B型构像向A型构像转变。C60具有显著的光动力学作用，其衍生物可以有效抑制爱滋病毒蛋白酶和逆转录酶的活性。严庆丰等采用傅里叶变换拉曼光谱术研究富勒烯C60对小牛胸腺DNA 的光动力学作用时发现，光激发 C60 对 DNA 各组分基团均有不同程度的损伤，其中 DNA 的空间构像破坏显著，腺嘌呤次之，骨架磷酸基团、脱氧核糖 嘧啶环等也遭到破坏并导致 DNA 链断裂。这种损伤并非由于C60与DNA分子之间直接的电子相互作用，而是通过单线态氧或、等自由基作用所致。生理pH值条件下二乙荃乙烯雌酚 (DES)和小牛胸腺DNA相互作用时，如果是低药物浓度，富含A-T区是插入的主要位点，如果药物浓度较高,则与G碱基对发生外部的沟槽连接并且有部分的螺旋损伤。药物的插入作用导致了部分B型DNA 构型转变成A型DNA。

5.展望
本文首先对拉曼光谱的基本原理及基本分类,然后又对激光拉曼光谱的4种分析方法做了简要介绍，并将每种分析方法所取得的进展进行了描述。拉曼光谱的研究方法也在不断完善，如由于拉曼光谱的散射强度较弱，同时为了克服对活生物样品进行拉曼散射研究时强大的荧光及散射干扰，近几年来又发展了傅里叶变换拉曼光谱、表面增强拉曼光谱、超拉曼光谱、共振拉曼光谱、时间分辨拉曼光谱等新技术等，拉曼光谱在各领域的作用也与日俱增。

在激光拉曼光谱在目前成熟技术应用的基础上，我相信激光拉曼光谱不仅在生命物质方面会有所突破，而且拉曼光谱技术以及拉曼光谱与其他仪器联用技术将会在分子生物学、免疫学、生物化学、生物物理学、食品、医药、环境和能源等领域中发挥更大的作用，成为研究各种分子结构以及物质间相互作用机理的更佳有力工具。

而新兴起的拉曼光谱技术如时间分辨拉曼光谱技术、曼光谱技术、共焦显微拉曼技术等正蓬勃发展，将在新的起点上成为生物分子研究的有力工具。我们相信随着激光技术和检测技术的发展和新的拉曼光谱技术和方法的提出，激光拉曼光谱技术必将得到更广泛的应用，促使对DNA等生物分子的研究不断深入。

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