土壤颗粒态有机碳（POC）和矿物结合态有机碳（MAOC）测定

前言

笔者是某211大学土壤学专业的学术硕士研究生，因专业要求原因做过一些相关实验。测定土壤颗粒态有机碳（Particulate organic carbon, POC）实验是其中之一，耗费心血甚多。做实验前在网上难以搜集完整可靠的实验方案，故我曾经千辛万苦搜集专业书籍资料、查阅文献、请教导师、实验师、师姐、室友等，最终总结出以下实验方案，现无偿分享，也是期盼能给当初像我一样需要相关参考的人一臂之力。
本实验方案经我试验是可行的，但还请读者根据各自所具备的实验室条件、土样条件并结合最新科学文献进行相应调整，一定要做预实验来摸清自家土样的测定习性。由于个人的实验需求不同，故实验的时间安排（包括实验进度、药品用量、实验耗材）并未展示在此文中。
此外，由于笔者经验学识有限，本文不当之处还请大家包涵，欢迎评论、指正。

一、方法原理

湿筛法+高温外热重铬酸钾氧化-容量法。湿筛法是使用六偏磷酸钠溶液（分散剂）打散团聚体，再根据粒径分级将POC和MAOC/MOC分离开来。高温外热重铬酸钾氧化-容量法是利用土壤有机碳在加热条件下被氧化剂重铬酸钾氧化产生二氧化碳，使用硫酸亚铁标准溶液滴定剩余的六价铬与空白氧化剂滴定之差计算有机碳含量。
TOC(Total Organic Carbon)=POC+MAOC/MOC(Mineral-associated organic carbon)

二、实验器材

油浴锅，震荡仪（摇床），万分位（千分位、百分位）电子秤，50ml（18cm以上的）试管，100ml三角瓶，53 μm（300目）筛，0.149mm(100)目筛，铝盒，1L及2L容量瓶，100ml棕色容量瓶，滴定管，移液管，洗耳球，2~3cm弯脚小漏斗，300℃温度计，大小烧杯，玻璃棒、玻璃注射器等玻璃器皿。

三、试剂

1.六偏磷酸钠溶液（5g·L^-1）:5.00g六偏磷酸钠固体++200ml UP水于烧杯溶解后定容于1L容量瓶。
2.重铬酸钾标准溶液（0.8000 mol·L^-1）：39.2245g重铬酸钾（分析纯）固体（120℃烘4小时）+200ml UP水于烧杯，加热溶解，冷却后移入1L容量瓶内定容。
3.硫酸亚铁溶液（0.2 mol·L^-1）：56.0g七水硫酸亚铁（化学纯）+200ml UP水于烧杯，+15ml硫酸（注射器），用水定容至1L容量瓶。
4.邻菲罗啉指示剂：1.485g邻菲罗啉+0.695g七水硫酸亚铁+70ml UP水于烧杯溶解后定容于100ml棕色容量瓶。
5.硫酸[H₂SO₄,ρ=1.84g·cm^-1，化学纯]。

四、操作步骤

（一）、分离出POC

1.称土：称取10.00g过2mm（10目）筛的风干土（大袋子里的土）于100ml清洁干燥细口三角瓶内；
2.振荡：加入50ml六偏磷酸钠溶液（5g/L）（保持土水比1：5），震荡（18℃ 90r/min）18h；
3.过筛：土壤悬浮液过53 μm（300目）筛（筛上为53-2000的砂粒组分），反复用反渗透水（RO）/去离子水(UP)洗后，将筛上部分移入已称重铝盒里（赶土）；
4.风干土：在60℃下过夜烘干称量(>16h)得到风干土。
5.研磨过0.149mm(100)目筛，装塑封袋，待测。

（二）、有机碳含量测定

在这个方法中，土壤样品首先与重铬酸钾（K₂Cr₂O₇）溶液反应，然后在外加热的条件下进行消煮。重铬酸钾在酸性条件下与有机物反应，被还原为Cr³⁺离子。消煮过程中，Cr⁶⁺离子被还原为Cr³⁺离子，同时有机碳被氧化为二氧化碳（CO₂）。消煮完成后，剩余的Cr⁶⁺离子通过滴定法用亚铁离子（Fe²⁺）溶液滴定至终点，终点时溶液颜色由橙黄色变为棕红色，Cr⁶⁺离子与亚铁离子（Fe²⁺）反应形成棕红色的络合物。反应式及相关原理如下图补充所示：


1.称土：称取过0.149mm(100)目筛的0.2000g（精确至最后一位）土样于50ml干燥硬质试管内，试管放于试管架上；
2.氧化：用移液管准确加入5ml重铬酸钾，玻璃注射器加入5ml浓硫酸，摇匀在试管口加入一弯脚小漏斗，以回流、冷凝水蒸汽；
3.加热：放在预热到170~180℃的油浴锅内，使试管内的溶液微沸，看到冒出密集气泡时开始计时，消煮5min。
4.定容：取出试管冷却片刻，用UP水冲洗弯脚小漏斗、试管，洗涤液收集于100ml的广口三角瓶内，瓶中液体总体积控制在60~70ml。
5.滴定：加3滴邻菲罗啉指示剂于三角瓶内，用硫酸亚铁滴定剩余的重铬酸钾。溶液颜色由橙黄—绿—棕（黄——绿——灰兰——棕红或砖红）为止。

五、注意事项

1、 每批样品分析时必须同时做3个空白（CK），不需要加二氧化硅，其他步骤与土样测定相同。
2. 烘干后的铝盒土样称重前需要放入干燥皿内，若放在台面上土壤会立刻吸水。
3. 重铬酸钾需要在120℃下烘4小时以上去除水分（一般烘的时间长比较好），烘干后拿出来立即放干燥皿里，冷却后称量。
4. 所有药品、土样的称量统一定为最后一位有效数字的正范围+3。如5.00g（5.00g ~ 5.03g）六偏磷酸钠固体、39.2245g（39.2245g ~ 39.2248g）重铬酸钾、56.0g（56.0g ~ 56.3g）七水硫酸亚铁等。
5. 可在土壤上称取0.2g二氧化硅，防止消煮时爆沸。但只要试管长度>=18cm，应该不需要此步骤。
6. 连同试管架一起放入油浴锅消煮时，从油浴锅内取出试管时戴棉手套，
7. 若土样内有机碳含量太高，称取的土样重量需要减少（0.1000 ~ 0.1500g，称量范围同前）。
8. 氧化试剂加完后，试管内溶液颜色为草黄色、黄红色（说明有机质含量少）都是正常的，若颜色为草绿色（有机质含量太高），此样废掉，减少称样量重做；
9. 消煮好的溶液颜色，一般应是黄色或黄中稍带绿色，如果以绿色为主，则说明重铬酸钾用量不足，减少称样量重做。
10. 在滴定时消耗硫酸亚铁量小于空白用量的1/3时，有氧化不完全的可能，应减少称样量重做。
11. 如果在重铬酸钾外加热法中，消煮后溶液的颜色变为黑色，这可能表明出现了一些问题。以下是可能导致黑色溶液的一些可能原因：
过量的有机物：如果土壤样品中的有机物含量过高，消煮过程中可能会产生过量的二氧化碳，导致溶液变黑。这可能是由于样品中的有机物含量超过了重铬酸钾的氧化能力。
（1）操作错误：消煮过程中的操作错误也可能导致溶液变黑。例如，加热温度过高或加热时间过长可能导致有机物过度燃烧或产生其他反应，导致溶液变黑。
（2）污染物：溶液中存在其他污染物，如金属离子、杂质或其他化学物质，可能与重铬酸钾反应产生复杂的化学反应，导致溶液变黑。

六、结果计算

公式（1）
O.C：有机碳；
V₀：空白标定硫酸亚铁的体积（ml），取3次的平均值为V₀；
V_x：滴定土样用去的硫酸亚铁体积（ml）；
m：烘干称样重（0.2000g~0.2003g）。

公式（2）
O.C：铝盒中有机碳含量；
m₁：铝盒烘干土样重量；
m₂：铝盒重量；
m₀：风干土重量（10.00~10.03g）;
k：水分系数=1/(1+水分含量）。

公式（3）
精密度检验：相对误差≤5%，不得超过10%。

七、溶液配制细节及原理

大神理解版

1. 0.5%的六偏磷酸钠溶液：在一般情况下，配置5g/L的六偏磷酸钠溶液不需要加热搅拌。六偏磷酸钠是一种易溶于水的化合物，通常只需要将其加入到足够的水中，然后用玻璃棒或磁力搅拌子（又称转珠、转子）轻轻搅拌即可。如果需要加快六偏磷酸钠的溶解速度，可以将水加热到40-50℃左右，但不需要沸腾。适当的加热可以加快其溶解速度，但过高的温度或过长的加热时间可能会导致六偏磷酸钠分解或水分蒸发，从而影响溶液的浓度和性质。在加热过程中，需要注意安全，避免烫伤或溅出热水。
   （称药品：铁勺、卫生纸、百分位称以上、1L烧杯、磁力搅拌加热器、玻璃棒、转珠、1L容量瓶）
2. 重铬酸钾标准溶液（0.8000 mol/L）：重铬酸钾分子量=294.212，当量=49.035，用多次结晶法制得的重铬酸钾配成的水溶液比较稳定，在长时间内保存不会有显著的变化。故需要在120℃下烘4小时去除水分（一般烘的时间长比较好）。重铬酸钾不像六偏磷酸钠那样易溶于水，因此在配制重铬酸钾标准溶液时需要加热。重铬酸钾的溶解度随温度的升高而增加，因此加热可以促进其溶解。一般来说，将水加热到60-70℃左右可以加快重铬酸钾的溶解速度，但不应超过80℃。过高的温度可能会导致其分解或水分蒸发，从而影响溶液的浓度和性质。在加热过程中，需要注意安全，避免烫伤或溅出热水。在重铬酸钾完全溶解后，应该冷却溶液至室温，然后移入1L容量瓶内定容。需要注意的是，重铬酸钾是一种强氧化剂，具有较强的腐蚀性和毒性，因此在操作过程中需要采取相应的安全措施，如佩戴防护手套、护目镜等。
3. 使用普通的1L透明玻璃容量瓶来配制重铬酸钾标准溶液（0.8000 mol/L），然后将其转移至棕色玻璃瓶中保存。这样可以避免光照和氧化对溶液的影响，同时也可以保证溶液的稳定性和安全性。在转移时，应该注意操作的卫生和安全，避免与有机物接触，避免产生危险。
4. UP水（去离子水）和RO水（反渗透水）都是实验室中常用的纯水类型，UP和RO是它们制备方法的缩写。UP是Ultra-Pure的缩写，意为“超纯水”。UP水是通过离子交换技术制备的超纯水，其纯度高于RO水和蒸馏水。UP水的制备过程中，通过离子交换树脂去除水中的离子和杂质，从而获得极高纯度的水。可以用于制备高纯度的化学试剂、生物试剂和电子元器件等。RO是Reverse Osmosis的缩写，意为“反渗透”。RO水是通过反渗透技术制备的纯水，其纯度高于自来水和蒸馏水，但低于UP水。RO水的制备过程中，通过反渗透膜去除水中的离子、微生物和有机物质，从而获得较高纯度的水。可以用于制备一般的化学试剂、生物试剂和实验室用水等。
   总之，UP和RO都是实验室用水的制备方法的缩写，UP水是通过离子交换技术制备的超纯水，RO水是通过反渗透技术制备的纯水。纯度上是UP水>RO水>蒸馏水>自来水。
5. 分析纯的七水硫酸亚铁因此在室温下搅拌均匀即可完全溶解，不需要加热。如果需要加热，建议控制温度在室温以下，以避免对溶液性质的影响。同时，加热时间也应该控制在必要的最短时间内，以避免过度加热导致溶液性质的变化。将56.0g七水硫酸亚铁加入烧杯中，加入适量的UP水，搅拌均匀，直到硫酸亚铁完全溶解。缓慢滴加/注射15ml硫酸，同时不断搅拌，然后再次搅拌均匀。用UP水定容至1L，最后颠倒倒置晃动来摇匀。
6. 邻菲罗啉指示剂是一种有机物，容易受到光照和氧化的影响，如果实在需要加热加快溶解，建议控制温度在50℃以下，以避免邻菲罗啉分解或氧化。同时，在加热过程中需要小心操作，避免产生危险。加热后，应该让溶液冷却至室温，再进行下一步操作。需要注意的是，加热可能会影响邻菲罗啉指示剂的性质和准确性，因此建议在不加热的情况下进行配制。建议使用棕色玻璃瓶保存，避免光照和氧化。如果需要长期保存，可以将邻菲罗啉指示剂放入冰箱中，以延长其使用寿命。

小白简易版

注：
即便需要加热来加快溶解，温度统一都定为温热，手感觉有热量即可，不得过高；
在3~5天的时间内，所有试剂都可以普通保存，节约保存步骤。

八、主要参考书籍

土壤农业化学分析方法，鲁如坤版。