【评测】lonza内毒素检测PyroGene rFC技术

PyroGene™ rFC试剂盒是Lonza公司生产的重组法荧光检测试剂盒，是传统内毒素的检测测试的演变。通过内毒素结合并激活的重组C 因子能够切割底物获得游离的荧光基团,荧光基团的释放与内毒素的浓度呈正比,从而使得内毒素被定量检测。

更多关于PyroGene rFC的信息可以参考试剂盒说明书

为了全面推广PyroGene rFC方法，LONZA公司花重金从BioTek Instruments定制了PyroWaveXM荧光内毒素检测仪，该仪器具有卓越的温控能力， rFC特异性专属光学元件，完美的支持rFC检测，提供稳定可靠的检测结果。

推荐仪器：

PyroWaveXM

试剂：

所有试剂，包括荧光溶质和检测用缓冲液，均必须无内毒素。必要时，根据测试盒生产商的指示要求溶解试剂。试剂应根据生产商要求冷藏或冷冻条件下存贮。

BET用水（细菌内毒素检测用水）：

注射用水R或采用其它方法生产的水，在试剂检测限水平不会与试剂发生反应。

标准内毒素贮备液制备：

标准内毒素贮备液采用经过国际标准如内毒素标准BRP标定的内毒素标准品制备，内毒素单位为国际单位（IU），国际标准的IU等同性由WHO规定。遵照包装说明书和标签上的要求制备和存贮标准内毒素贮备液。

标准内毒素溶液制备：

剧烈混合标准内毒素贮备液，使用BET用水制备适当级别稀释液，溶液应尽快使用以避免活性因吸收而降低。

供试液制备：

用BET用水溶解或稀释原料药或制剂制备供试液。有些原料药和制剂可能需要溶解或解释在其它水性溶液中。必要时，调节供试液pH值（或稀释）使得试剂与供试液混合物的pH值在测试盒生产商所指定的pH范围内，通常为6.0-8.0。可根据测试盒生产商的建议使用酸碱或适当的缓冲液调整pH。酸碱可采用浓缩物或固体经BET用水在没有可检出内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证无可检出内毒素和干扰因子。

最大有效稀释度确定：

按照试剂盒或药典描述的方法进行确定。

荧光定量检测：

本实验是基于内毒素浓度和试剂混合物在孵育结束后的荧光之间的定量关系，表示为ΔRFU。

ΔRFU= RFUtend-point- RFUt0

RFUt0：孵育开始时试剂混合物荧光，对于所有的待测样品来讲，RFUt0应该是非常接近的，表明所有待测样品本底信号是均匀一致的，没有其他因素的干扰。

RFUtend-point：孵育结束时试剂混合物荧光

在检测盒生产商所建议的孵育温度进行检测（通常为37 ±0.5°C）。

预检测：

预检测是为了确保荧光技术有效性。此检测是为了证明满足标准典线的标准，并且供试液对检测无干扰。

标准曲线标准：

仪器灵敏度必须根据每批rFC或标准内毒素进行调整，其设置必须符合测试盒生产商的建议。使用标准内毒素溶液，在试剂盒生产商指定的浓度范围内制备至少3个内毒素浓度溶液，制作标准曲线。如果所需范围超出生产商所指定浓度范围的2个以10为底的浓度对数，则必须包括更多标准以覆盖范围内每个浓度对数增加值。按生产商建议（体积比、培养时长、温度、pH等），每个标准内毒素溶液至少配制3份重复检测。

在所制备的内毒素浓度范围内，相关系数绝对值|r|必须大于等于0.980。

干扰因子：

由于rFC试剂盒没有因子G，因此无法激活假阳性β-葡聚糖。在将本方法与其它细菌内毒素定量方法进行比较时必须考虑此情况。

选择等于或接近于内毒素标准曲线中间值的内毒素浓度。按下表要求配制溶液A、B、C和D。按检测合生产商要求每个溶液至少检测2次（供试液和测试试剂盒混合物体积，供试液与测试试剂盒混合物的体积比，培养时间等）。

溶液A=供试液，可稀释但不得超过MVD

溶液B=与溶液A相同稀释倍数配制后检测，添加了等于或接受标准曲线中间浓度内毒素

溶液C（阳性控制）=标准内毒素溶液

如果满足以下要求，则认为检验有效

• 溶液C制作的标准曲线的相关系数r绝对值大于等于0.980
• 溶液D所得结果不得超过所用试剂混合物描述所要求的空白限值，或低于所用rFC的内毒限检测限。
• 从添加了内毒素的溶液中（溶液B，上表）扣除溶液中平均内毒素浓度（如有）（溶液A，上表）计算平均回收率。
• 如果在检测条件下，供试液中添加内毒素后检出浓度扣除未添加前溶液中检出的内毒素后，为已知添加浓度的50-200%，则认为供试液没有干扰因子。

如果内毒素回收率超出指定范围，则认为供试液含有干扰因子。使用不超过MVD的更大稀释倍数重复检测。另外，供试液或稀释后供试液（未超过MVD）的干扰有可能通过执行适当的经验证的处理方法消除，例如，过滤、中和、渗析、热处理或内毒素专用绑定步骤（在没有干扰基底时，检测之前从供试液中富集内毒素）。为证明所选处理方法可有效消除干扰而不损失内毒素，应使用待检样品添加标准内毒素和进行所选处理的样品重复干扰因子测试。

检测程序

检测程序和预检测步骤基本是一样的，把需要的检测样品作为供试品即可。Lonza和Hyglos都有特别编写的程序，完成供试品在板上的分布后，直接运行即可。仪器会自动完成检测并给出检测分析结果。

RFUt0、RFUtend-point检测结果示意图

所有供试品及标准品的RFUt0的初始值都在同一水平上。

以logΔRFU和log标准品的浓度值做线性拟合，得到下图标准曲线

标准曲线的回归系数，r2应大于0.9604，即r绝对值大于0.980，才能判定标准曲线有效。

系统会自动判断是否符合预设的条件，给出有效或无效的结论。

如果空白对照（BLK）的平均内毒素浓度低于标准品的最低内毒素限值，则认为符合要求。

至此，rFC检测基本完成，每个公司可以根据自己公司的要求，编辑自己特殊要求的检测报告，审计追踪，电子签名，QC趋势图等等，就不再一一赘述。

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