【整理】WB蛋白样品制备常见问题大全

一直都在做蛋白研究，但是样品制备中的小细节你都了解吗？这里为大家整理了蛋白样品制备中大大小小的常见问题，一起来学习吧！

 

Q贴壁细胞收集是刮下来好还是胰酶消化好？

A两种方式都是可行的，各有利弊。不必担心刮刀收集会刮坏细胞，胰酶消化的程度掌握不好，也会让细胞破损。胰酶消化可能会对某些膜蛋白产生影响，刮刀收集效率会略低，可根据自己的实验来选择细胞收集的方式。做总蛋白提取时，可选择直接在器皿中进行裂解，无需提前收集。

PS：使用刮刀收集时，可加入PBS帮助收取细胞。

 

Q所有WB实验都用总蛋白就可以完成吗？

A当然不是，要根据WB的实验目的来确定提取哪类蛋白，如需验证某些低丰度蛋白，或蛋白定位，或组分间表达量对比，则需要进行亚细胞结构分离或组分分离。

 

Q提蛋白时要不要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂？

A蛋白样品如果长期保存，或者下游实验过程较长，建议加入蛋白酶抑制剂。做磷酸化研究，一定要加入磷酸酶抑制剂！

 

Q如需添加蛋白酶抑制剂该如何添加？

A内源性蛋白酶存在于胞浆中，所以要在细胞裂解前加入抑制剂到达最佳抑制效果，提取时将抑制剂添加到裂解液中，工作浓度1X。例如100X蛋白酶抑制剂，1ml裂解液中添加10ul即可。

 

Q用RIPA提取总蛋白为什么会有粘稠的不可溶沉淀？是什么？如何解决？

A产生粘稠物的主要原因是RIPA不能将所有样品全部裂解，产生的不可溶组分中主要含有核酸残团，细胞碎片（有些组织样品还含有油脂），和部分蛋白，因此RIPA提取的仅仅是可溶性蛋白，并非真正的总蛋白。

解决方案：使用柱式法蛋白提取真正意义上的总蛋白

 

Q不同时间点处理细胞，如何收集进行蛋白提取更合理？

A最好是收集完细胞后马上进行蛋白提取。

 

Q浓度测定哪家强？

A浓度测定方法很多，目前推荐使用兼容性较好的BCA法进行浓度测定。

 

Q蛋白样品如何储存？

A蛋白样品不建议久存，也不要反复冻融。下游做WB实验，建议蛋白浓度测定后，加入loading buffer煮样，煮后根据实验需要分装成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮样即可。

 

Q样品上样前怎么处理？

A蛋白浓度测定后，建议将各个样品稀释到某一固定浓度（稀释可以PBS，水或裂解液），加入loading buffer后，在沸水中煮3-5分钟，使蛋白充分变性，也可使用PCR仪95度加热5分钟。

PS：煮沸并非必须步骤，膜蛋白建议70℃或者更低温度煮。

煮后在冰上静置少许时间，进行低速离心，即可上样。

 

Q组织样品含血量多可以直接提蛋白吗？

A如组织样品中含血较多，血红蛋白可能会影响下游实验， 可以在组织样品裂解前使用红细胞裂解液进行处理后，再进行蛋白提取。

 

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