诺禾-实验技巧之WB篇

关于蛋白质免疫印迹（Western Blot，即 WB），想必做蛋白实验的小同伴们都不会生疏，作为免疫学中最常用的一种实验办法，其根本原理是经过特异性抗体对凝胶电泳处置过的细胞或生物组织样品停止着色。经过剖析条带大小和着色深度取得特定蛋白质在所剖析的细胞或组织中表达状况的信息。

那么为了防止呈现以上问题，下面就由小编给大家梳理一下 WB 中常见的问题以及处理办法。

一、信号强度低
信号强度低是指在正常曝光条件下得到的目的条带微小或是没有目的条带，而增加曝光时间又会招致背景高、杂带多等问题。扫除试剂质量、操作失误等方面的影响，这一类问题产生的主要缘由如下：

① 样本蛋白表达量缺乏。倡议添加蛋白表达量较高的细胞系作为阳性对照，或是恰当增加上样量以取得较高程度的信号；
② 蛋白质降解。在蛋白样品制备期间留意蛋白酶抑止剂 PMSF 的运用，所制备的样品尽快检测或妥善保管；
③ 蛋白的转膜。运用恰当孔径的膜，同时优化转膜时间，关于高分子量蛋白可能需求更长的转膜时间。
④ 抗体的运用。抗体的反响种属与实验类型需求可以满足实验的需求，此外，抗体的稀释比、孵育时间等问题也需求在实验中不时优化；
⑤ 蛋白与抗体分离率低。减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中 NaCl 浓度等；
⑥ 抗原被封锁液遮盖。换用不同的封锁液，优化封锁液中蛋白质浓度并缩短封锁时间；
⑦ 甲醇浓渡过高。会招致蛋白质与 SDS 别离，并沉淀在凝胶中，同时使凝胶收缩或变硬，从而抑止高分子量蛋白的转移。实验中可恰当降低甲醇浓度或者运用乙醇、异丙醇替代。

二、非特异性条带或条带位置不对
WB 结果中目的条带之外的条带被称为非特异性条带，有时非特异性条带很明显，却没有目的