测序数据比对结果格式（sam, bam, bw）

SAM (Sequence Alignment/Map) 文件是一种用于存储测序数据比对结果的文本格式，广泛用于基因组学分析。它由一个 可选的头部 和 比对数据部分 组成。

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1. SAM 文件格式结构

(1) 头部（Header）

头部行以 @ 开头，通常包含比对信息、参考序列信息等，例如：

@HD     VN:1.4  SO:coordinate@SQ     SN:chr1 LN:248956422@SQ     SN:chr2 LN:242193529@PG     ID:bwa  PN:bwa  VN:0.7.17-r1188

• @HD

  ：文件格式信息，VN 代表 SAM 版本，SO 表示排序方式（coordinate 或 unsorted）。

• @SQ

  ：参考序列信息，SN 代表染色体名称，LN 代表该染色体的长度。

• @PG

  ：比对软件信息，如 bwa。

(2) 比对数据部分（Alignment Section）

比对数据部分由 11 个必需字段和可选字段组成，每行代表一个比对的序列。例如：​​​​​​​

M01234:56:000000000-A0CDW:1:1101:15098:1734  99   chr1  10027  60  50M  =  10076  99  AGCTTAGCTAGCTACCTATATCTTGGTCTTGGCCGATGCTTTGAC   IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII   NM:i:0  MD:Z:50  AS:i:50  XS:i:25

 

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2. SAM 文件每列字段含义

字段编号	字段名称	说明
1	QNAME	读取序列的名称（如测序 read ID）
2	FLAG	比对标志，表示 read 的方向、单端/双端等
3	RNAME	参考序列名称（染色体号）
4	POS	比对起始位置（1-based）
5	MAPQ	比对质量分值（0-60，越高表示比对可靠性越高）
6	CIGAR	CIGAR 字符串，表示比对操作（如 50M 代表 50 个匹配碱基）
7	RNEXT	配对 read 的参考序列名称（= 表示与当前 read 在同一参考序列上）
8	PNEXT	配对 read 的比对起始位置
9	TLEN	片段长度（配对 read 之间的距离）
10	SEQ	序列本身
11	QUAL	序列的 Phred 质量分数（ASCII 编码）
12+	可选字段	例如 NM:i:0（错配数）、MD:Z:50（比对匹配情况）、AS:i:50（比对得分）等

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3. 关键字段解析

(1) FLAG（比对标志）

FLAG 是一个 整数，表示 read 的比对状态。常见 FLAG 含义：

FLAG 值	意义
0	单端比对，正向链
16	单端比对，负向链
99	双端比对，read1，正向链
147	双端比对，read2，负向链
4	未比对
2048	次要比对（Secondary Alignment）
示例 ：
99  = 1 + 2 + 32 + 64（即 0x63），解析如下：

• 1

  （paired）= 成对比对

• 2

  （properly paired）= 配对成功

• 32

  （mate reverse strand）= 配对 read 在反向链

• 64

  （read1）= 该 read 是 pair1

可以用 samtools flagstat 解析 FLAG 统计信息。

(2) CIGAR（比对信息）

CIGAR 字符串表示 read 如何比对到参考基因组。常见符号：

符号	含义
M	匹配（match）
I	插入（insertion）
D	缺失（deletion）
S	软剪切（soft clipping）
H	硬剪切（hard clipping）
N	跨内含子（spliced alignment）

示例：

• 50M

  ：表示 read 的 50 个碱基完全匹配参考序列

• 10M1I10M1D30M

  ：表示 10 个匹配碱基，1 个插入，10 个匹配碱基，1 个缺失，30 个匹配碱基

(3) MAPQ（比对质量）

• 60

  ：唯一比对，质量最高

• 0

  ：多重比对，低质量

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4. 常见分析工具

1. samtools（查看、转换、过滤）​​​​​​​

samtools view -h input.sam | less  # 查看 SAM 文件samtools flagstat input.sam        # 统计 FLAG 信息samtools view -bS input.sam > output.bam  # 转换为 BAM 格式

2. awk 提取特定染色体 reads​​​​​​​

awk '$3 == "chr1" {print}' input.sam > chr1_reads.sam

3. 提取比对质量高的 reads​​​​​​​

awk '$5 >= 30' input.sam > high_quality.sam

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5. 总结

• SAM 文件包含比对信息，分为头部（@ 开头）和比对数据部分。
• 比对数据部分由 11 个字段（QNAME、FLAG、RNAME、POS、CIGAR 等）组成。
• FLAG、CIGAR、MAPQ 是解析比对质量和方式的关键字段。
• 可以使用 samtools 进行基本操作，如转换、过滤和统计。

SAM 文件是 RNA-Seq、ChIP-Seq 和 WGS 数据分析的重要格式，熟练掌握其结构有助于优化生物信息分析流程！ 

BAM 文件格式解析

BAM (Binary Alignment/Map) 文件是 SAM 文件的二进制版本，用于存储高通量测序数据的比对结果。它比 SAM 更紧凑，占用更少存储空间，并且可以更快地进行数据操作。BAM 是二进制格式，需要使用专门的工具（如 samtools）来查看和操作。

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1. BAM 文件结构

BAM 文件与 SAM 文件的基本信息相同，主要由两部分组成：

1. 头部（Header）：

    包含比对软件信息、参考基因组信息等。

2. 比对数据（Alignment Section）：

    以二进制格式存储比对结果，每条 reads 占据一行。

由于 BAM 是二进制文件，不能直接用 cat 或 less 查看，需要用 samtools view 进行转换：​​​​​​​

samtools view input.bam | less -S

这会将 BAM 转换为可读的 SAM 格式，便于分析。

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2. BAM 文件头部

头部部分包含 @ 开头的元信息，与 SAM 文件相同，例如：​​​​​​​

@HD     VN:1.4  SO:coordinate@SQ     SN:chr1 LN:248956422@SQ     SN:chr2 LN:242193529@PG     ID:bwa  PN:bwa  VN:0.7.17-r1188

• @HD

  ：文件格式信息，如 VN (版本) 和 SO (排序方式)。

• @SQ

  ：参考序列信息，如 SN (染色体名称) 和 LN (长度)。

• @PG

  ：比对工具的信息，如 bwa 版本。

查看 BAM 头部：​​​​​​​

samtools view -H input.bam

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3. BAM 比对数据部分

比对数据部分的每一行代表一个比对 read，与 SAM 文件相同，但存储方式为二进制格式。使用 samtools view 解析：​​​​​​​

M01234:56:000000000-A0CDW:1:1101:15098:1734  99   chr1  10027  60  50M  =  10076  99  AGCTTAGCTAGCTACCTATATCTTGGTCTTGGCCGATGCTTTGAC   IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII   NM:i:0  MD:Z:50  AS:i:50  XS:i:25

字段解释：

字段编号	字段名称	说明
1	QNAME	读取的 read ID
2	FLAG	比对标志，表示 read 的方向、配对情况等
3	RNAME	参考序列名称（染色体号）
4	POS	比对起始位置（1-based）
5	MAPQ	比对质量分值（0-60，越高越可靠）
6	CIGAR	CIGAR 字符串，表示比对情况
7	RNEXT	配对 read 的参考序列名称
8	PNEXT	配对 read 的比对起始位置
9	TLEN	片段长度（配对 read 之间的距离）
10	SEQ	序列本身
11	QUAL	质量值（Phred 质量分数）
12+	可选字段	例如 NM:i:0（错配数）、MD:Z:50（匹配信息）、AS:i:50（比对得分）

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4. 重要字段解析

(1) FLAG (比对标志)

FLAG 是一个 整数值，用于表示 read 的比对状态。可以使用 samtools flagstat 统计 FLAG 信息：​​​​​​​

samtools flagstat input.bam

常见 FLAG 值：

FLAG 值	含义
0	单端比对，正向链
16	单端比对，负向链
99	双端比对，read1，正向链
147	双端比对，read2，负向链
4	未比对
2048	次要比对（Secondary Alignment）

解析 FLAG：​​​​​​​

samtools view -f 99 input.bam  # 提取 FLAG = 99 的 reads

(2) CIGAR (比对信息)

CIGAR 字符串表示 read 如何比对到参考序列：

符号	含义
M	匹配（match）
I	插入（insertion）
D	缺失（deletion）
S	软剪切（soft clipping）
H	硬剪切（hard clipping）
N	跨内含子（spliced alignment）

示例：

• 50M

  ：表示 read 完全匹配 50 个碱基

• 10M1I10M1D30M

  ：表示 10 个匹配碱基，1 个插入，10 个匹配碱基，1 个缺失，30 个匹配碱基

(3) MAPQ（比对质量）

• 60

  ：唯一比对，最高质量

• 0

  ：低质量或多重比对

筛选高质量比对：​​​​​​​

samtools view -q 30 input.bam > high_quality.bam

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5. BAM 文件常见操作

(1) 查看 BAM 文件​​​​​​​

samtools view input.bam | less -S

(2) 提取特定染色体 reads​​​​​​​

samtools view -b input.bam "chr1" > chr1_reads.bam

(3) 统计比对质量​​​​​​​

samtools flagstat input.bam

(4) 过滤未比对的 reads​​​​​​​

samtools view -b -F 4 input.bam > mapped.bam

(5) 将 BAM 转换为 SAM​​​​​​​

samtools view -h input.bam > output.sam

(6) 按坐标排序 BAM​​​​​​​

samtools sort input.bam -o sorted.bam

(7) 索引 BAM 文件​​​​​​​

samtools index sorted.bam

生成的 sorted.bam.bai 文件可以加速查询。

(8) 提取特定基因区域​​​​​​​

samtools view -b input.bam "chr1:1000000-2000000" > region.bam

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6. 总结

• BAM 是 SAM 的二进制格式，占用空间小，处理速度快。
• 头部 (@) 包含参考基因组信息，比对数据存储为二进制。
• 使用 samtools view 解析 BAM，字段与 SAM 文件相同（QNAME, FLAG, CIGAR, MAPQ 等）。
• samtools 提供排序、过滤、转换、索引等常见操作，提高分析效率。

BAM 是基因组测序分析的核心格式，熟练掌握 BAM 操作对生物信息学分析至关重要！ 

BigWig（BW）文件格式解析

BigWig（.bw） 是高效存储 定量基因组数据（如 测序覆盖度、表达水平、甲基化水平）的二进制格式。它是 Wig（WIG）格式 的二进制压缩版本，占用空间更小，支持快速随机访问，常用于可视化基因组数据（如 IGV、UCSC Genome Browser）。

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1. BigWig 文件特点

• 二进制格式

  ，压缩存储，文件小，加载快。

• 可快速查询

   某个基因组区域的数据，适合大规模数据集。

• 支持可视化

  （UCSC Genome Browser、IGV、DeepTools）。

• 基于 Wiggle（WIG）格式

  ，但比 WIG 更高效。

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2. BigWig 的数据内容

BigWig 主要存储 基因组上每个碱基的定量信号，如：

• ChIP-seq

   或 ATAC-seq 覆盖度

• RNA-seq

   转录本表达水平

• DNA 甲基化水平
• 核小体定位

BigWig 不能直接打开，需要用 bigWigToBedGraph 或 bigWigSummary 解析。

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3. BigWig 文件的生成

BigWig 由 WIG 或 BedGraph 文件转换而来，通常用 UCSC 工具（bedGraphToBigWig） 或 DeepTools 生成。

(1) BedGraph 转换为 BigWig​​​​​​​

# 先对基因组构建染色体大小信息cut -f1,2 genome.fa.fai > genome.chrom.sizes
# BedGraph 转 BigWigbedGraphToBigWig input.bedgraph genome.chrom.sizes output.bw

(2) BAM 直接转换为 BigWig

用 DeepTools 计算 BAM 覆盖度并转换：​​​​​​​

bamCoverage -b input.bam -o output.bw --binSize 10 --normalizeUsing CPM

bamCoverage -b input.bam -o output.bw --binSize 10 --normalizeUsing CPM

参数：

• --binSize 10

  ：窗口大小 10bp

• --normalizeUsing CPM

  ：标准化为每百万 reads 计数

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4. 解析 BigWig 文件

(1) 转换为 BedGraph​​​​​​​

bigWigToBedGraph input.bw output.bedgraph

(2) 查询特定区域的信号​​​​​​​

bigWigSummary input.bw chr1 1000000 1010000 10

返回 chr1:1000000-1010000 区域，按 10 个 bins 计算的均值信号。

(3) 可视化 BigWig

• UCSC Genome Browser
• IGV
• DeepTools plotProfile​​​​​​​​​​​​​​

computeMatrix reference-point -S input.bw -R genes.bed -o matrix.gzplotProfile -m matrix.gz -out profile.png

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5. 总结

• BigWig 是二进制 Wiggle 格式，占用小，查询快。
• 适用于基因组覆盖度、表达水平、甲基化等定量数据。
• 可通过 bedGraphToBigWig 或 bamCoverage 生成。
• 使用 bigWigToBedGraph 或 bigWigSummary 解析，支持 IGV/UCSC 可视化。

BigWig 是 高效基因组数据存储格式，广泛用于生物信息分析！ 

生信大白记第53记，就到这里，关注我！

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