BLAST比对

BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，基本局部比对搜索工具）是一种广泛用于生物信息学的序列比对算法，主要用于核酸或蛋白质序列在数据库中的搜索与比对。其核心原理是基于局部比对的启发式算法，能够快速识别高相似度的序列区域，而无需进行全局比对。

以下是BLAST的介绍：

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1. BLAST的基本流程

BLAST的比对过程主要分为五个步骤：

1. 种子匹配（Seed Matching）
2. 种子扩展（Extension）
3. HSP筛选（High-scoring Segment Pairs, HSPs）
4. 统计评估（Scoring & Evaluation）
5. 结果输出（Output & Reporting）

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2. 详细比对原理

（1）种子匹配（Seed Matching）

BLAST使用k-mer（短字词）索引法快速寻找目标数据库中可能的匹配区域：

• 先将查询序列切割成多个k-mer（k-字母短词），默认k值：

  • 蛋白序列

    ：默认 k = 3（称为三肽）

  • DNA序列

    ：默认 k = 11

• 然后，将这些短词在数据库序列中寻找完全匹配或近似匹配的区域。

• 通过**索引表（Hash Table）**快速查找候选区域，避免直接进行全局比对。

👉 例子：

• 查询序列（蛋白）：MKTLLL

• k = 3，则生成短词：

  MKT, KTL, TLL, LLL

• 在数据库中查找是否存在这些短词的匹配项。

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（2）种子扩展（Extension）

当找到匹配的**种子序列（seed word）**后，BLAST会尝试向两侧延伸，以获得更长的匹配区域：

• 采用动态规划方法（类似Smith-Waterman算法），在匹配点两侧扩展比对。

• 计算比对分数（alignment score）：

  • 匹配（Match）

    ：+得分

  • 错配（Mismatch）

    ：-罚分

  • 空位（Gap）

    ：-罚分

• 直到比对分数下降到一定阈值（低于“下降值” drop threshold），停止扩展。

👉 例子：

Query:  ...MKTLLLSIV...
Database: ...MKTLLLSLV...

比对过程中：

MKTLLLSIV
MKTLLLSLV   （仅S -> I 替换）

扩展过程在检测到替换（S -> I）后继续，但如果进一步错配过多，扩展会停止。

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（3）HSP筛选（High-scoring Segment Pairs, HSPs）

• **HSP（高得分片段对）**是指具有较高匹配得分的局部比对区域。

• BLAST使用**阈值（threshold）**来过滤低质量比对：

  • 仅保留高得分的HSP。

  • HSP通常是比对结果的核心，BLAST会基于这些HSP进行进一步统计分析。

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（4）统计评估（Scoring & Evaluation）

BLAST采用统计学方法评估比对的可靠性，主要计算：

1. Bit Score（比特分数）

比特分数用于比较不同BLAST运行之间的可比性：

• 计算公式：

  

  
   

• 其中：

• S：原始比对得分
• λ（Lambda）和 K：基于数据库和查询序列计算的参数

• Bit Score越高，代表比对越可靠。

2. E-value（期望值）

E-value 表示随机匹配出现在数据库中的概率，计算公式：

其中：

• m：查询序列长度
• n：数据库中序列总长度
• λ（Lambda）和 K：校正参数
• S：比对得分

解释：

• E-value 越小，说明比对越可靠。

• 一般情况下，E < 1e-5（0.00001） 的比对结果被认为是显著的。

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（5）结果输出（Output & Reporting）

BLAST最终输出：

1. 匹配序列ID
2. 比对得分（Bit Score）
3. E-value
4. HSP区域的比对细节
5. 查询序列与数据库序列的比对图示

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3. BLAST的优化

（1）不同BLAST算法

BLAST 有多个变体：

BLAST 版本	适用对象	说明
BLASTN	DNA vs DNA	用于核酸比对，适用于长序列
BLASTP	蛋白 vs 蛋白	适用于蛋白质序列比对
BLASTX	DNA vs 蛋白	查询序列为DNA，翻译成蛋白后进行比对
TBLASTN	蛋白 vs DNA	数据库序列为DNA，翻译成蛋白后比对
TBLASTX	DNA vs DNA	双方均翻译成蛋白，再进行比对

（2）参数优化

用户可以通过调整word size（种子长度）、**gap penalty（缺口罚分）**等参数优化比对：

• 更小的word size

  （如BLASTN设为 7）提高灵敏度，适用于短序列比对。

• 调整gap penalty

   可以优化插入缺失（Indel）检测。

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4. BLAST的局限性

虽然BLAST比对快速高效，但仍有局限：

1. 局部比对

   ：不适用于全局比对，可能错过远端关系。

2. 对大数据的计算要求高

   ：BLAST比对百万序列时计算量较大。

3. 对长序列不够精确

   ：不适合基因组级别的长序列比对（推荐使用BWA、Bowtie等）。

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5. 总结

• BLAST基于启发式方法，先寻找短词匹配，再进行扩展比对，并通过统计方法评估显著性。

• 计算E-value 评估比对的可靠性，Bit Score 进行评分比较。

• 适用于DNA、RNA、蛋白等生物序列的比对，在基因注释、进化分析、功能预测等方面广泛应用。

BLAST比对的基本命令流程

BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）主要用于DNA、RNA 和蛋白质序列的比对，能够快速搜索数据库并找到相似序列。以下是BLAST比对的完整命令流程，包括安装、数据库构建、查询比对、结果解析等步骤。

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1. 安装BLAST

如果你尚未安装BLAST，可以使用以下方法进行安装：

（1）Linux / macOS

使用conda或apt安装：

# 使用conda安装（推荐）
conda install -c bioconda blast

# Ubuntu/Debian系统
sudo apt update && sudo apt install ncbi-blast+

（2）Windows

可以从NCBI官方网站下载：https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/

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2. 准备数据库

BLAST比对需要一个数据库作为参考，通常可以选择：

• NCBI数据库

  （如nt、nr）

• 自定义序列数据库

（1）下载NCBI公共数据库

如果要比对核酸序列，可以使用nt（核酸库）：

如果要比对蛋白序列，可以使用nr（蛋白库）：

update_blastdb.pl --decompress nr

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（2）自定义BLAST数据库

如果要比对自己的基因组或蛋白序列，需要先用makeblastdb创建数据库。

① 创建DNA数据库

假设你有一个参考基因组genome.fa，可以用以下命令创建BLAST数据库：

makeblastdb -in genome.fa -dbtype nucl -out genome_db

 

参数解析：

• -in genome.fa

  ：输入的FASTA文件

• -dbtype nucl

  ：指定数据库类型（核酸 nucl 或 蛋白 prot）

• -out genome_db

  ：输出数据库名称

② 创建蛋白数据库

如果比对的是蛋白序列：

makeblastdb -in proteins.fasta -dbtype prot -out protein_db

 

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3. 运行BLAST比对

BLAST提供多个程序，适用于不同类型的比对：

BLAST工具	适用情况
blastn	DNA vs DNA
blastp	蛋白 vs 蛋白
blastx	DNA vs 蛋白（先翻译）
tblastn	蛋白 vs DNA（数据库翻译）
tblastx	DNA vs DNA（双向翻译）

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（1）DNA序列比对（blastn）

如果你的查询序列是DNA，需要比对到基因组，可以使用blastn：

blastn -query query.fa -db genome_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

参数解析：

• -query query.fa

  ：查询序列

• -db genome_db

  ：参考数据库

• -evalue 1e-5

  ：E-value阈值（值越小结果越可靠）

• -outfmt 6

  ：输出格式（6表示表格格式）

• -num_threads 4

  ：使用4个线程加速

示例输出（表格格式-outfmt 6）：

query1  scaffold_1  97.8  300  0  0  100  400  5000  5300  1e-50  200query2  scaffold_2  95.6  250  3  1  50   300  8000  8250  2e-40  180

字段解析：

1. Query ID（查询序列名称）

2. Subject ID（比对的目标序列）

3. 相似度（% identity）

4. 比对长度（alignment length）

5. 错配数（mismatches）

6. 缺失数（gap openings）

7. Query起始位点

8. Query终止位点

9. Subject起始位点

10. Subject终止位点

11. E-value

12. Bit score

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（2）蛋白序列比对（blastp）

如果要比对蛋白质序列（蛋白 vs 蛋白），使用blastp：

blastp -query query_protein.fa -db protein_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

 

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（3）DNA vs 蛋白比对（blastx）

如果你的查询序列是DNA但要比对蛋白数据库（先翻译再比对），使用blastx：

blastx -query query.fa -db protein_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

 

这适用于**预测基因编码区（CDS）**的功能注释。

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（4）蛋白 vs DNA比对（tblastn）

如果你的查询序列是蛋白，但目标数据库是DNA（将DNA翻译后比对），使用tblastn：

tblastn -query protein.fa -db genome_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

 

这可以用于寻找基因组中的蛋白编码区。

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（5）DNA vs DNA翻译比对（tblastx）

如果查询序列和数据库都是DNA，但希望都翻译为蛋白后再进行比对：

tblastx -query query.fa -db genome_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

 

这种方法计算量较大，但可以检测远缘同源序列。

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4. 结果筛选与分析

BLAST 结果通常需要进一步筛选：

（1）提取高质量比对结果

awk '$3 > 90 && $4 > 100' results.txt > filtered_results.txt

解释：

• $3 > 90

  ：相似度 > 90%

• $4 > 100

  ：比对长度 > 100 bp

（2）统计比对数量

wc -l results.txt

 

（3）可视化BLAST比对

可以用blast_formatter转换为HTML格式：

blastn -query query.fa -db genome_db -out results.html -evalue 1e-5 -outfmt 7

 

然后用浏览器打开results.html查看。

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5. 总结

完整BLAST流程

1. 安装BLAST：

   conda install -c bioconda blast

2. 准备数据库

   ：

   • 下载NCBI数据库：

     update_blastdb.pl --decompress nt

   • 自建数据库：

     makeblastdb -in genome.fa -dbtype nucl -out genome_db

3. 运行BLAST比对：

   blastn -query query.fa -db genome_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

4. 筛选结果：

   awk '$3 > 90 && $4 > 100' results.txt > filtered_results.txt

生信大白记第58记，就到这里，关注我！

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