文献简述丨单细胞多组学研究破译小鼠原肠胚形成机制

在小鼠的原肠胚中，精确的表观基因组和转录组指令引导多能干细胞分化为三个主要胚层（内胚层，中胚层和外胚层）的细胞，从而有助于脊椎动物“身体计划”的构建。虽然我们对计划中这个发展阶段的转录部分有一个大致的了解,但我们仍然缺乏相关认识。比如表观遗传的改变是如何以及何时决定基因的表达或抑制？又是如何决定细胞自主选择和“动物体计划”的建立？

为了充分探索这些生物指令，需要通过对极其微量的细胞进行多层次的分析。来自Babraham研究所、EMBL欧洲生物信息学研究所、CRUK剑桥研究所和Wellcome-MRC剑桥大学干细胞研究所的研究人员（由Oliver Stegle, John C. Marioni, and Wolf Reik领导的梦之队）最近承担了这项发生在小鼠原肠胚中的艰巨任务。

Argelaguet和他的同事们使用单细胞核小体组、甲基化组小体和转录组测序（scNMT-seq）对从小鼠胚胎中分离出的一千多个单细胞进行了分析，这些细胞退出多能状态并形成特定胚层。为了帮助将表观遗传“指令”与转录谱和随后的细胞自主选择联系起来，作者还使用了多组学因子分析（multi-omics factor analysis MOFA），该方法将来自RNA测序的基因表达数据与来自DNA甲基化和染色质可及性分析的调控元件数据整合在一起，然后进行无监督的降维（unsupervised dimensionality reduction），通过少量的推断因子捕获细胞到细胞变异的整体变化来源。

那么，这一套细致缜密的关于形成小鼠，甚至是人体最佳“身体”计划的表观遗传指令研究，到底告诉了我们什么？

在发育过程中，细胞逐渐失去多能性，这是由胚胎及胚外组织从甲基化和染色质开放区域逐渐减少这些抑制性表观遗传所驱动的。

在被评估的5000个基因中，分别有125个和52个基因的表达与启动子DNA甲基化和染色质可及性显著相关，主要包括受抑制的早期多能性和生殖细胞标记。

有趣的是，只有少数上调的基因在启动子序列上表现出表观遗传的改变，这暗示了其他调控元件的参与。

随后利用MOFA对胚层表观基因组进行鉴定，一旦细胞退出多能状态，早期的胚胎细胞在增强子区域表观遗传化，自主向外胚层发育，这一发现代表一个默认分化途径的存在（如许多多能干细胞中观察到的）。

MOFA将中胚层和内胚层DNA甲基化改变的过程中基因表达的增加（由10-11易位（TET）介导的去甲基化驱动）和沿谱系特异性增强子处染色质可及性的增加联系起来。

这些增强子相关的表观遗传变化驱动中胚层和内胚层转录特有变化，从而使得细胞脱离默认分化为外胚层的途径。

总的来说，作者通过分级或不对称的表观遗传模型为原肠胚形成过程中胚层表观遗传基因组的定义提供了证据;在增强子元件上的胚层特异性表观遗传学改变为细胞自主选择、不同胚层的出现和脊椎动物体的形成提供了指导。

共同第一作者斯蒂芬J.克拉克（Stephen J.Clark）说：“通过分析事件的时间轴，我们发现三个原肠胚层的多样化主要是由影响胚层特异性增强子的表观遗传事件所驱动的。我们发现，尽管这三种细胞类型在相似的时间出现，但是外胚层表观基因组的构建在发育过程中比其他两种早得多。”

共同作者Wolf Reik表示，“我们的发现发展了我们对表观基因组在不同发育阶段决定细胞自主选择作用的认识，这对干细胞生物学和医学具有重要意义。很高兴看到多学科研究界在这个项目中聚集到一起，分享他们努力的成果。”

参考文献：Argelaguet R, Clark SJ, Mohammed H, et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 2019;576(7787):487–491. doi:10.1038/s41586-019-1825-8

附 易基因动物发育重编程单细胞多组学科研技术服务

流程一：用温和的细胞裂解液裂解单个细胞后，离心裂解产物。将上清液转移到新的管子中并以Smart-seq2方法做转录组测序分析; 下方细胞核沉淀则用于以随机引物扩增方法进行全基因组甲基化测序分析。

单细胞平行甲基化组和转录组测序技术文库构建流程（如下图）

流程二：利用单细胞平台捕获单个细胞后，裂解细胞并利用转座酶攻击开放状态染色质区域，催化转座子结合到基因组上，然后利用 EDTA解离释放转座酶并用MgCl2猝灭EDTA，延伸并补齐转座片段的末端缺口。qPCR定量转座片段后，从ICF上搜集单细胞ATAC文库， 用含有双端barcode的引物进行PCR扩增以获得完整的ATAC文库，最后将混合文库进行高通量测序分析。

单细胞染色质开放结构 ATAC-seq测序技术文 库构建流程（如下图）