易基因 - 学科前沿：多组学联合分析揭示COVID-19患者普遍存在的先天免疫和造血功能失调问题｜文献科普

易点评

人们对导致2019年冠状病毒病(新冠肺炎)的SARS-CoV-2病毒的保护性免疫反应与病理性免疫反应的理解并不充分。在这篇文章中，作者对64名新冠肺炎患者进行了多组学单细胞免疫图谱分析，这些患者涵盖了新冠肺炎的多个进展阶段，从轻度的门诊患者到致命病例都包括在内。研究中的转录组学、表观基因组学和蛋白质组学分析显示，严重和致命性的新冠肺炎患者普遍存在先天免疫功能障碍，包括中性粒细胞和NK细胞的显著高激活的特征。作者还发现NF-κB结合位点染色质可及性的改变是严重和致死性新冠肺炎明显缺乏促炎细胞因子产生的潜在机制；还进一步证明了紧急造血是致死性新冠肺炎的一个显著特征。总体而言，作者的研究结果揭示了新冠肺炎中与疾病严重程度相关的免疫表型，并确定了可能作为治疗干预目标的发病相关途径。

研究背景

由SARS-CoV-2引起的新冠肺炎是一场大型紧急的公共卫生危机。新冠肺炎有一个高度可变的病程：20%的感染者需要住院治疗，5%的感染者需要进行重症监护，而高达40%的患者没有明显症状。人体对SARS-CoV-2的免疫反应是决定新冠肺炎严重程度和预后的关键因素，因此了解新冠肺炎发病的免疫学基础对于预测、预防和治疗SARS-CoV-2感染是至关重要的。

严重的新冠肺炎与许多不同的免疫学特征有关。例如，血清促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、IP-10、肿瘤坏死因子α以及S100A8和S100A9的升高与较差的预后相关。新冠肺炎还以严重程度特定的方式重新配置白细胞表型，严重的新冠肺炎与淋巴细胞耗竭、中性粒细胞激活和造血改变相关。虽然这些发现中的大多数已经通过转录组和蛋白质组学得到了验证，但严重疾病表现背后的基因调控变化还没有得到确定。

相对而言，人们对SARS-CoV-2免疫应答对重度新冠肺炎患者的保护作用知之甚少，因为到目前为止，大多数病例群体分析只包括了住院患者。在轻度症状的患者中检测到中和抗体和病毒特异性T细胞反应，这为整个疾病的适应性免疫反应提供了证据。值得注意的是，轻度新冠肺炎患者的促炎血浆细胞因子水平要低得多，而组织修复因子水平却较高，这表明在轻度疾病中免疫反应可以根除病毒，而不会引发在重度病例中所观察到的高炎症现象。因此，为了确定免疫反应的保护性和病理学特征，作者的目标是同时研究轻度(世界卫生组织评分1-3，无氧需求)、中度(世卫组织评分4-5，无创伤性需氧量)和重度(世卫组织评分6-8，插管)新冠肺炎病例。

为了进行表观遗传学、转录组学和蛋白质组学的联合免疫分析，作者对一组新冠肺炎患者的外周免疫细胞进行了scATAC-seq、scRNA-seq和CyTOF。作者发现了许多与疾病严重程度相关的免疫学特征，包括中性粒细胞激活和单核细胞功能障碍、2型常规树突状细胞(CDC2)和自然杀伤(NK)细胞相关的强烈信号。此外，作者在致死病例中发现了紧急造血现象的有力证据；还发现了与这些转录和蛋白质组变化相关的表观遗传学变化，表明单核细胞中关键的促炎细胞因子编码基因的调控元件的可及性和转录情况的协调变化。总而言之，这些研究结果揭示了对SARS-CoV-2免疫反应及其保护机制的新见解。

研究结果

SARS-CoV-2外周免疫应答的三种单细胞模式图

为了研究不同严重程度的新冠肺炎间免疫应答的差异，作者用三种高维单细胞模式分析了64名新冠肺炎患者和12名健康对照者的外周血液免疫细胞。首先研究了新冠肺炎如何影响外周免疫细胞的组成。作者发现三种模式之间免疫细胞的组成相似，包括CD16单核细胞、树突状细胞(DC)和NK细胞的减少，以及在重症和致死性新冠肺炎患者中浆母细胞(PB)的增加(图1E)。值得注意的是，在轻度病例中，细胞亚群的比例在中度和重型患者中基本没有变化，除了浆细胞样树突状细胞(PDCs)，它在所有严重病例中都大幅度减少(图1E)。

图1

多模态映射可实现对细胞亚型的准确标记和分析

准确识别免疫细胞的亚型对于研究新冠肺炎如何重组免疫系统至关重要。在本研究中，每种细胞类型的干扰分数是这样计算的：首先识别新冠肺炎样本和健康对照样本之间存在差异表达的基因，计算这些基因在新冠肺炎样本和健康对照样本之间的假空白表达载体的差异，最后将每个志愿者的整个转录组映射到这个载体上。因此，这个分数代表了基因表达的整个转录组转移的大小，同时也揭示了细胞亚型的变化与疾病严重程度相关的模式(图2B)。这种多模式参考映射方法使作者能够对免疫细胞亚群进行以前不可行的转录分析。例如，作者确定CDC2细胞是新冠肺炎中主要的重塑DC亚群；这些细胞在严重疾病中耗尽，具有明显的疾病严重相关性(图2B-E)。

CD8 TEM细胞也表现出与严重程度相关的转录变化(图2B、G和H)。值得注意的是，CD8效应器的几个标志物，如PrF1、GZMB和CX3CR1，主要在轻度新冠肺炎患者中下调(图2I)。此外，在重症和致死性新冠肺炎患者中，CD8 TEM细胞保留了效应器能力的标志物的表达，但没有表现出衰竭的特征(图2J)。总之，这些分析提供了转录证据，表明过度活跃的外周细胞毒性T细胞反应可能与严重的新冠肺炎有关。

图2

COVID-19敏感以严重程度特定的方式重塑外周免疫表型

鉴于患者之间采样时间的异质性(图1 B)，作者检查了疾病时间点对免疫表型的影响。这些分析受到作者转录数据集中轻度疾病急性感染患者样本量小的限制。尽管如此，这些分析表明，恢复期对轻度疾病患者转录表型的影响要小得多。这些结果表明，轻度新冠肺炎可能以最小或快速解决的全身免疫反应为特征，这一发现得到了作者包含更多受试者的细胞因子分析的正交支持。恢复期最受干扰的细胞类型包括CD8TEM和CD14单核细胞；在中度疾病患者中，B细胞在恢复期也受到干扰，显示免疫球蛋白基因的下调。需要对所有严重程度组进行额外的纵向取样，以明确这些特征。

重度新冠肺炎病患者单核细胞功能障碍的出现

作者接下来分析了新冠肺炎外周细胞的表型，因为这些细胞似乎在三种模式(图1C，D和F-I)中都有不同程度的变化。从转录组数据中可以看出这种表型转变(图3 A)。与以前的报告类似，随着疾病严重程度的增加，多种干扰素刺激基因(ISGs)以及一些标记物，如CD163、PLAC8和MPO(图3B和C)的表达上调。这些结果共同表明，抑制性和功能失调的单核细胞是严重和致死性新冠肺炎的特征，这与以前的研究一致。

新冠肺炎单核细胞的蛋白质组分析发现了CD16+单核细胞的缺失以及CD14+单核细胞表型的明显改变(图3G-I)。正如作者在转录组数据中观察到的，在严重新冠肺炎病人样本的单核细胞中，人类白细胞抗原决定簇和CD4的表达发生丢失。重要的是，在轻度新冠肺炎患者中没有观察到这种蛋白质组重构(图3 G)。轻度疾病患者的应激标志物CD112的表达没有显著增加，也没有上调CCR2，CCR 2参与重度新冠肺炎病患者气道单核细胞的募集，尽管这两种标志物在重度疾病患者中都上调了(图3G-I)。这些结果表明，单核细胞在严重的新冠肺炎患者中发生变化，但轻度的新冠肺炎对单核细胞蛋白质组的影响很小。

图3

NF-κB缺乏可能是严重新冠肺炎病患者外周血促炎细胞因子产生的不良原因

作者接下来利用染色质可及性数据来研究新冠肺炎通过κB控制促炎细胞因子表达的调节机制。首先，对κB基序的全基因组分析显示了κB结合活性与新冠肺炎严重程度的相关性降低(图4A和B)，与作者基于RNA的TF活性分析一致。利用染色体分析从每个细胞的染色质可及性来量化转录因子活性，作者发现轻度病例的κB活性增加，重度病例的κB活性显著降低(P = 0.0047；图4C)。

为了研究可能解释重症和致死性新冠肺炎病患者促炎细胞因子下调的潜在基因调控机制，作者检测了编码IL1B和CCL2基因座周围染色质可及性的变化。作者鉴定了IL1B下游假定的增强子(图4D)。这种假定的增强子显示严重的新冠肺炎病患者的可及性显著降低(P = 0.0081；图4E)。此外，该元件含有一个κB结合基序，表明它可能受κB家族转录因子的调节(图4D)。作者还发现炎症细胞因子CCL2位点上含有κB基序的峰的可及性发生了变化(图4F)。以上结果表明，在严重的新冠肺炎病例中，κB活性的异常降低可能导致关键细胞因子特定的增强子可及性的丧失。

图4

重症新冠肺炎患者外周血NK细胞耗尽，具有高度活化的表型

接下来，作者分析了新冠肺炎样本中NK细胞的变化。如前所述，尽管CD56bright、CD56dim和CD56−NK细胞在所有NK细胞中所占的百分比没有改变(图5A和B)，但在所有三种模式中，外周血NK细胞都大量耗尽(图5A和B)。重症新冠肺炎患者外周血NK细胞的耗竭可能反映了NK细胞向感染部位的转运。作者还注意到，几个典型的NK细胞激活基因的上调推动了转录重组，包括细胞毒效应分子编码基因GZMB和PRF1的高表达，以及增殖标记MKI67和XAF1等ISGs的高表达(图5C和D)。来自中度和重度的新冠肺炎患者的NK细胞也显示出耗尽的转录组证据(图5D)。

接下来，作者在蛋白质水平上研究了NK细胞的激活信号。作者证实了先前已知的NK细胞生物学变化，包括激活标记CD38和CD69表达的增加。（图5E和F）所展示的数据，再加上重症和致死性新冠肺炎患者NK细胞耗尽的转录组证据(图5D)，表明NK细胞细胞毒性缺陷可能与不良预后有关。

图5

NK细胞受体和配体的动态变化可能是新冠肺炎严重程度相关NK激活的基础

为了探讨NK细胞活化的机制，作者分析了CD38+CD69+活化的NK细胞受体的变化。不出所料，中重度新冠肺炎患者活化的NK细胞比例显著增加(图6A和B)。值得注意的是，在作者的scRNA-seq数据中，激活受体DNAM1(CD226)和NKG2D在激活的新冠肺炎样本中的NK细胞表达与健康对照组相比显著下调(图6C)，尽管这些蛋白在作者的scRNA-seq数据中的总NK细胞中的表达没有变化(图6D)。因为DNAM-1和NKG2D的表达发生了下调，所以作者研究了DNAM-1配体Nectin-2(CD112)和NKG2D识别的ULBP蛋白的丰度。与健康对照组相比，新冠肺炎患者外周血单核细胞上Nectin2和ULBP的表达均显著上调(图6E)。作者还发现TIGIT和CD96的表达都没有变化，TIGIT是一种与DNAM-1竞争Nectin-2结合的抑制性受体，CD96识别DNAM-1的另一配体CD155(图6F)。

作者还观察到CD14+单核细胞上LLT-1的表达缺失，这似乎与疾病的严重程度有关，在致死样本中几乎全部丧失(图6G)；然而，作者发现NK细胞上识别LLT-1的抑制性受体CD161的表达没有变化(图6H)。图7I总结了重症新冠肺炎表达的激活和抑制受体和配体的总体概况，表明在这些样本中观察到的激活表型可能是由通过DNAM-1和NKG2D接收的激活信号以及通过CD161缺乏的抑制信号所驱动的。

图6

高度激活的中性粒细胞标志着严重和致死的新冠肺炎病例

对红细胞裂解的全血进行Seq-Well处理，产生33,276个高质量的中性粒细胞单转录本(图7A)。这些细胞统一和特异地表达中性粒细胞的编码基因，包括CSF3R和CXCR2(图7A)。新冠肺炎中性粒细胞转录表型被大规模重塑，部分原因是PADI4的表达上调，这是中性粒细胞胞外陷阱激活和释放所必需的，IL-8受体CXCR1，包括S100A8和S100A9(图7B和C)，它们共同诱导中性粒细胞的趋化和粘附。作者还注意到，在中度和重度新冠肺炎患者中，ISG的诱导与疾病严重程度相关，但在轻度患者中并不如此(图7D)。虽然在中、重度患者的大多数细胞类型中都检测到了这种ISG信号，但中性粒细胞上调了最多的ISG数量。重要的是，新冠肺炎重度组之间中性粒细胞表达ISGs的差异并不是由于患者之间感染时间点的不同，轻度新冠肺炎患者的中性粒细胞在感染期间的任何时间点都没有上调ISGs(图7D)。

图7

结论
总体而言，这篇研究首次代表了三模式的表观基因组、蛋白质组和转录组学联合分析，这些数据涵盖了广泛的疾病严重程度与新冠肺炎的外周免疫反应的关系。通过识别与新冠肺炎死亡率相关的新免疫特征以及轻度疾病患者的免疫状态，作者的工作增强了人们对病理性免疫反应与保护性免疫反应的理解，并突出了几个治疗开发的机会。

公司介绍
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公司主要以表观基因组学、宏基因组学和转录组学为核心业务方向，并整合代谢组学和蛋白质组学内容，为科研院所、医院和生物医药公司等提供国际领先的高通量测序和生物信息学数据分析技术服务。公司的研发团队在以表观基因组学为核心的多组学整合分析方面具有丰富项目经验，在复杂疾病发病机制、动植物发育调控和分子育种等研究场景可以为客户进行多水平（DNA, RNA和染色质）表观遗传修饰注释、转录和转录后水平调控机制、基因表达模式、单细胞组学、营养与菌群代谢物和宿主基因组互作关系等内容的研究提供帮助。公司还自主开发了血浆游离DNA甲基化高通量测序文库试剂盒、微生物样品采集与保存试剂盒等，助力生命科学研究。公司与国内外多家知名企业和单位建立了战略合作关系，共同致力于为生物医药领域和生命科学研究提供性能卓越的产品和优质的服务。如果您有任何技术、科研上的问题和需求请联系我们！

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