易基因 | 学科前沿：转录组测序在原核生物研究中的应用（3）

低温下嗜温蜡样芽孢杆菌群和耐冷蜡样芽孢杆菌群的形态特征和冷响应基因表达

易点评

在低温条件下，耐冷蜡样芽孢杆菌菌株的生长速率高于嗜温菌株。然而，耐冷品系(BCG34)和嗜温品系(BCGT)在低温下的生存情况尚不清楚。作者研究了BCGT和BCG34的形态和基因组特征，以确定它们在低温下的生长情况。在低温条件下，BCGT的形态发生了变化。这些形态变化包括杆状细胞的伸长，而BCG34的细胞形状在低温下没有变化。转录分析表明，这两个物种在低温生长过程中表现出了不同的生长相关机制。BCGT菌株诱导脂肪酸的生物合成、硫的同化以及蛋氨酸和半胱氨酸的生物合成是其在低温环境中的生存机制。嗜温蜡状芽孢杆菌能量代谢和脂肪酸生物合成的增加可能解释了它在低温下的生存能力。参与碳水化合物机制的几条途径下调，以保存生存所需的能量。肽聚糖的生物合成上调，这意味着RNA-Seq和RT-qPCR中基因表达的变化有助于维持其在低温下的生长。这些结果加深了作者对蜡样芽孢杆菌(包括耐冷蜡样芽孢杆菌)在低温下生存情况的理解，并为食品工业中抑制细菌方法的改进提供了帮助。

介绍

蜡样芽孢杆菌包括20多个遗传相似的种，即B. anthracis, B. cereus, B. cytotoxicus, B. mycoides, B. pseudomycoides,B. thuringiensis, B. toyonensis, B. weihenstephanensis和B. wiedmannii等，它们可以根据毒力基因的存在和表达而引起人或昆虫的炭疽病或食源性疾病。耐冷蜡样芽孢杆菌，如 B. weihenstephanensis和B. wiedmannii，可以在7℃或更低的温度下生长，而其他蜡样芽孢杆菌在低于10℃的温度下不能生长。因此，耐冷蜡样芽孢杆菌可以在各种冷藏食品(如乳制品)的生产、销售和储存过程中存活。由于耐冷蜡样芽孢杆菌具有肠毒素或呕吐毒素基因，因此对其在冷藏食品中的存在进行监测，对于提高食品安全至关重要。

由于冷藏可以保留食品中的营养和口感品质，因此市场对冷藏食品的需求不断增加。而冷藏可能会为细菌的生存和耐冷蜡样芽孢杆菌的生长提供有利的环境。在低于最适温度时细菌可以通过改变脂肪酸组成来增加细胞膜的流动性。细菌通过增加RNA转录和翻译来抑制蛋白质折叠和稳定核酸结构，从而保证它们能够在低温下生存。低温对细菌生存和生长的影响已有报道。根据Becker等人的说法，Listeria monocytogenes利用一种冷胁迫下的适应性反应机制，包括改变其细菌膜的脂肪酸组成来维持膜的流动性。大肠杆菌对低温的适应与不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸比例的增加有关。在枯草芽孢杆菌中，对低温的反应涉及到大量的脂肪酸和参与翻译机制的蛋白质。蜡样芽孢杆菌在低温下的生长也与细菌膜中不饱和脂肪酸的比例高于在最佳生长温度下发现的不饱和脂肪酸有关。

一般来说并不认为蜡样芽孢杆菌是一个耐冷性物种，但耐冷蜡样芽孢杆菌在10℃以下具有生长能力，并在低温下成功定殖。在之前的研究中，作者从冷链配送的新鲜蔬菜中分离到一株耐冷的蜡样芽孢杆菌。蜡样芽孢杆菌的耐冷机制已被研究，但有关耐冷蜡样芽孢杆菌(无需冷适应即可定殖)在低温条件下生存情况的研究有限。在这项研究中，作者调查了耐冷性蜡状芽孢杆菌是否表现出与嗜温蜡状芽孢杆菌相似的低温反应。本研究利用电子显微镜和转录组测序技术，在最适(30℃)和低温(10℃)条件下比较了各个蜡样芽孢杆菌菌株的相关转录和形态变化，为蜡样芽孢杆菌(包括耐冷菌)在低温下的反应提供更多的参考。

结果

低温下嗜温蜡状芽孢杆菌和耐冷性蜡样芽孢杆菌的生长能力

分别选择BCGT和BCG34作为嗜温蜡状芽孢杆菌菌株和耐冷性蜡状芽孢杆菌菌株，并测定了它们在低温下的生长速率。虽然BCGT和BCG34在10℃下均能正常生长，但BCG34的生长速度要快于BCGT(图1a，b)。

在7℃时，BCG34的生长能力降低，而BCGT完全无法生长。因此，作者继续比较了嗜温蜡状芽孢杆菌和耐冷性蜡样芽孢杆菌在低温下的形态和转录变化情况，以了解这两个不同的蜡状芽孢杆菌菌株之间的生存反应差异。

 图1

显微观察嗜温蜡状芽孢杆菌和耐冷性蜡样芽孢杆菌在低温下的形态

利用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察了嗜温蜡样芽孢杆菌和耐冷蜡样芽孢杆菌在最适温度和低温条件下培养后的形态变化，为更好地了解不同蜡样芽孢杆菌在低温下的生长能力提供帮助。在30℃培养后，BCGT和BCG34均具有完整的、带有条纹的粗糙表面(图2a，d)。在30℃下生长的BCGT和BCG34细胞也表现出正常的杆状形态，细胞长度为1934~2753µm，但在10℃培养的BCGT和BCG34细胞表现出不同的形态特征(BCGT和BCG34分别如图2b，c和图2e，f所示)。具体地说，在10℃下生长的BCGT细胞比在30℃下生长的BCGT细胞更长，在实验中检测到的细胞长度从平均2.742µm(观察到BCG34细胞)到最大7890µm(观察到BCGT细胞)不等。在低温条件下仅在BCGT细胞中观察到细长细胞的形态。这些结果与其他研究人员得到的结果是一致的。在盐胁迫条件下，观察到单个蜡样芽孢杆菌细胞在生长过程中会形成丝状结构。蜡样芽孢杆菌ATCC 14579在有氧条件下培养，观察到15℃时比37℃时的细胞更大。

细胞分裂发生在不同的阶段：DNA复制、细胞加长、隔膜形成、隔膜定型和细胞分离。伸长和分裂需要肽聚糖的合成，肽聚糖是保护细菌免受环境胁迫的细胞壁的重要组成部分。在细胞伸长和分裂过程中仔细协调肽聚糖的生物合成是细胞存活所必需的。伸长和分裂之间的动态平衡被破坏，抑制细胞壁的合成，可能会导致细菌死亡。在低温下，一些BCGT细胞形成气孔，而另一些细胞则明显收缩和塌陷，一些细胞壁和细胞膜部分破裂(图2b)。然而，在10℃激活的BCG34细胞大部分保持其原始形状，观察到大部分细胞壁和细胞膜保持完整，细胞壁保持完整可以使细胞内容物(如蛋白质和核酸)很少外流。已有研究报道，抗菌药物的作用机制包括细胞壁降解、细胞质膜或膜蛋白损伤、胞内内容物外泄、胞质凝聚和质子动力耗竭等。当BCGT细胞处于低温时，可能无法保持其质子动力，这些动力的不平衡会导致形态变化，从而使肽聚糖降解，最终导致细胞膜损坏以及内部和细胞壁相关酶的释放。在10℃培养条件下，嗜温蜡样芽孢杆菌与耐冷蜡样芽孢杆菌之间的形态变化差异表明，与在10℃激活的耐冷蜡样芽孢杆菌相比，低温激活的中温蜡状芽孢杆菌可能更容易受到其他环境胁迫的影响。

 图2

冷反应相关基因的差异表达分析

嗜温蜡状芽孢杆菌和耐冷性蜡样芽孢杆菌在低温下的转录组测序分析结果如表1所示。

在嗜温蜡样芽孢杆菌30℃的条件下鉴定出28,171,092个read(BCGT_C)；10℃的条件下鉴定出30,171,092个read(BCGT_T)。在耐冷蜡样芽孢杆菌30℃的条件下鉴定出25,381,698个read(BCG34_C)；10℃的条件下鉴定出36,039,900个read(BCG34_T)。为了研究低温对蜡样芽孢杆菌(BCGT)生存的影响，对不同条件下获得的数据进行了DEG分析，比较了30℃和10℃的差异。其中共有317个基因在BCGT中差异表达，其中172个基因在BCGT中表达上调，145个基因在BCGT中表达下调(图3)。

 

 图3

根据GO富集分析，BCGT中在30℃和10℃之间存在差异表达的基因主要富集在小分子生物合成过程、有机酸生物合成过程、脂质代谢过程和羧酸生物合成这几个功能中(图4a)。此外，共有202个基因在BCG34中差异表达，其中85个基因表达上调，117个基因分表达下调(图3)。BCG34中的大多数DEG被归类为生物合成过程、低温响应、tRNA-氨基酰化、氮化合物代谢过程、细胞蛋白质代谢过程、肽代谢过程和生物过程中的翻译过程(图4b)。与30℃相比，参与糖酵解途径、三羧酸循环、核糖体途径、抗生素生物合成途径和次生代谢物生物合成途径的基因在10℃时表达下调，参与肽聚糖生物合成和细胞壁生物合成的基因表达上调。

 图4

结论

低温贮藏是保持食品品质、抑制食源性致病菌生长的有效方法。然而，这种策略可能不适合于抑制耐冷蜡样芽孢杆菌的生长，因为这些菌株能够在寒冷条件仍然保持较好的生长状态。因此我们需要了解低温下细菌生长的相关机制，来达到通过抑制冷供应链配送的食品中蜡样芽胞杆菌的增殖频率来改善食品安全的目的。作者对一株嗜温蜡样芽孢杆菌和一株耐冷性蜡样芽孢杆菌在低温条件下的转录分析表明，这两种菌株在低温条件下的生存方式是不同的。嗜温蜡样芽孢杆菌采用常见的细菌胁迫机制在低温下生长。例如，该菌株在低温条件下表现出对硫的吸收增加，诱导半胱氨酸和谷胱甘肽的生物合成，脂肪酸生物合成的上调，从而促进了细菌的生长。同时，耐冷蜡样芽孢杆菌的碳水化合物代谢被抑制以节省生长所需的能量，而负责色氨酸和酒精分解代谢的基因表达上调则通过为NAD再生和ATP水平的平衡提供替代途径来调节能量生产。此外，增加肽聚糖的生物合成有助于保护耐冷蜡样芽孢杆菌群菌株在低温下的细胞形态和细菌生长。本研究结果加深了作者对嗜温蜡样芽孢杆菌和耐冷性蜡样芽孢杆菌对低温环境下细菌生存反应的理解，并将指导包括耐冷性菌株在内的蜡样芽孢杆菌在低温下生长控制策略的制定。

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