易基因：基于cfDNA甲基化的液体活检在胰腺疾病中的研究进展 | 3文一览

易基因科技

于 2022-03-14 15:58:55 发布

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大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

本期通过3篇基于cfDNA甲基化的液体活检在早期检测胰腺疾病中的研究成果，对cfDNA甲基化液体活检在疾病早期诊断中的研究进展及其对于胰腺疾病治疗的潜在价值进行讨论。（特别说明：仅分析讨论论文的主要组织结构和框架思路，不关心论文具体研究的科学问题）

01 cfDNA甲基化谱准确预测急性胰腺炎严重程度

标题：Accurate prediction of acute pancreatitis severity based on genome-wide cell free DNA methylation profiles

期刊：Clin Epigenetics

影响因子：IF 6.551

发表时间：2021.12.16

技术平台：RRBS

背景：

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）患者死亡率较高，因此早期诊断和提前干预对提高患者生存率至关重要，然而常规检查在急性胰腺炎（AP）分层中受到限制。本研究目的是通过将丰富的临床检测结果和cfDNA甲基化标志物相结合来评估AP的严重程度。

方法：

在多个时间点采集61例AP患者的175份血液样本，并采集24份健康人群的血液样本作为对照组。所有样本的全基因组cfDNA甲基化谱均采用简化重亚硫酸盐测序（cfDNA-RRBS进行表征。基于cfDNA甲基化和常规血液生物标志物单独和组合构建SAP预测模型。对AP患者进行覆盖93种生物标志物的临床血液检测。

研究设计、预测模型构建和验证流程图

结果：

利用RRBS测序技术绘制的cfDNA全基因组甲基化谱，作者共鉴定出565个AP标志物和59个SAP标志物，预测急性胰腺炎及其严重程度。基于cfDNA甲基化标志物构建的AP和SAP预测模型AUC值（Area Under Curve）分别为0.92和0.81。系统筛选12种常规血液生物标志物，结果发现12种标志物对SAP的敏感性为87.5%，对轻度急性胰腺炎的特异性为100%，显著高于现有的血液检测。将12种常规血液生物标志物与59种cfDNA甲基化标志物相结合的扩展模型进一步将SAP预测敏感性提高至92.2%。

图：常规临床试验检测的血液生物标志物水平可用于SAP早期的准确诊断

结论：

以上研究结果表明，通过将传统常规检查和新型血液分子标志物相结合，可以准确预测SAP，为通过非侵入式快速诊断进行SAP早期有效干预奠定基础。

02 cfDNA甲基化特征区分胰腺癌和良性胰腺囊肿

标题：Liquid biopsy, using a novel DNA methylation signature, distinguishes pancreatic adenocarcinoma from benign pancreatic disease

期刊：Clin Epigenetics

影响因子：IF 6.551

发表时间：2022.02.22

技术平台：qPCR

摘要：

本研究验证了血液样本中cfDNA甲基化标志物在区分转移性胰腺癌和良性胰腺囊肿的能力，并使用定量cfDNA甲基化分析来监测肿瘤动力学。结果发现cfDNA甲基化标志物能够以高敏感性和特异性来区分恶性样本和良性疾病样本（AUC = 0.999）。此外，生物标志物能够检测到接受化疗的患者样本中肿瘤源性cfDNA甲基化持续下降。本研究证明cfDNA甲基化生物标志物从血浆中检测到转移性胰腺癌，区分恶性胰腺癌和良性胰腺囊肿。表明液体活检可能在胰腺癌患者的治疗中发挥必要的作用。

背景：

胰腺癌（PDAC）是一种相对罕见的疾病，占所有癌症病例的3%；然而由于大部分PDAC属于晚期诊断，其5年生存率仅为10%。癌症及其复发的早诊断早干预，可能改善疾病的管理。临床上可用的血液生物标志物，如糖类抗原19-9(Carbohydrate antigen19-9,CAl9-9)在检测早期胰腺癌不准确，其在炎症性胰腺炎和胆道梗阻的情况下可能呈假阳性结果，在Lewis抗原阴性的晚期患者中可能结果正常。而从血液活检中检测cfDNA中肿瘤特异性DNA甲基化可用于胰腺癌的诊断和监测。

方法：

队列：19例未手术切除的转移性胰腺癌患者（实验组） VS 44例良性胰腺囊肿患者（对照组）。所有癌症病例在抽血时均经病理检查为胰腺癌， 9名实验组转移性胰腺癌患者在治疗开始前（C1周期）和治疗开始后4周（C2周期）采集样本。采集血液并提取分离cfDNA和重亚硫酸盐处理，两步法qPCR。

结果：

（1）基于cfDNA甲基化生物标志物的液体活检，可以区分良性和恶性胰腺疾病，具有非常高的敏感性和特异性。

图：A. 对照组44例良性胰腺囊肿患者样本和19例胰腺癌患者样本的每个标志物平均DNA甲基化水平

B. 44名对照组样本和19名癌症患者样本的生物标志物ROC分析

（2）胰腺癌治疗期间cfDNA甲基化标志物纵向变化分析，结果发现cfDNA甲基化水平降低可能与较低的疾病负荷相关。胰腺癌治疗过程导致血浆中肿瘤源性DNA减少，表明cfDNA甲基化生物标志物可能有助于监测接受胰腺癌治疗的患者。

图：DNA甲基化生物标志物在检测胰腺癌治疗后疾病负荷的差异

03 cfDNA甲基化全基因组分析用于胰腺癌早期诊断

标题：Genome-Wide Analysis of Cell-Free DNA Methylation Profiling for the Early Diagnosis of Pancreatic Cancer

期刊：Front Genet.

影响因子：IF 4.599

发表时间：2020.12.02

技术平台：cfMeDIP-seq

研究背景：

近年来，cfDNA液体活检由于其临床优势而引起了医学界的更多关注。在肿瘤发生期间，细胞坏死和细胞凋亡的增加导致cfDNA富集，可以在相对较早的阶段检测到。此外，cfDNA不仅包含与肿瘤细胞相同的突变，而且具有相同的甲基化模式，从而为早期癌症诊断，甚至对于那些隐藏的器官（如胰腺和胆管）的诊断提供了可能和便利。本研究旨在通过MeDIP-seq鉴定胰腺导管腺癌（PDAC）诊断中潜在的cfDNA甲基化生物标志物。

方法：

通过MeDIP-seq分析，将PDAC的cfDNA差异甲基化区域（DMR）与正常对照组进行比较，鉴定出143个高甲基化DMRs，主要位于基因启动子区域并与CGI重叠。再与公开的DNA甲基化数据交叉验证后，鉴定出可以用作PDAC患者早期检测的八个生物标志物，包括TRIM73，FAM150A，EPB41L3，SIX3，MIR663，MAPT，LOC100128977和LOC100130148。

胰腺癌cfDNA甲基化生物标志物筛选流程图

结果：

（1）PDAC患者和健康对照组样本之间存在表观遗传学差异

（2）胰腺癌患者和健康对照组启动子区域的差异甲基化区域（DMR）

（3）胰腺癌患者和健康对照组CpG区域的差异甲基化区域（DMR）

（4）胰腺癌患者样本在启动子和CGIs区域中的差异甲基化基因

（5）使用公开的DNA甲基化数据交叉验证潜在的候选基因

（6）胰腺癌患者与正常对照组之间8个标志物DNA甲基化水平分析

结论：

通过MeDIP-seq技术对全基因组cfDNA甲基化进行分析，发现了8种可用于早期胰腺癌的非侵入性诊断的潜在生物标志物，有望成为临床胰腺癌早期诊断的有效方法。这8种胰腺癌生物标记物分别为：MAPT、SIX3、MIR663、EPB41L3、FAM150A、TRIM73、LOC100128977和LOC100130148。

关于cfDNA甲基化检测

WGBS，太贵！

RRBS，位点太少！

对于cfDNA等相对微量且片段化十分严重的样本，常用甲基化检测主要包括cfMeDIP，微量WGBS技术。应用RRBS检测的CG位点极为有限，主要原因cfDNA自身就在选择片段范围之内，如果片段内CG含量高被酶切，反而更短不被富集，因此可能检测到的都是CG含量低的区域片段。

为助力低样本量多维度分析，易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的cfDNA甲基化测序方法——cfDNA-RBS，实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞。

易基因建立的cfDNA-RBS技术，仅需10-15G测序数据，DNA建库起始量低至5ng的cfDNA样本，可以检测到的5X位点高达4M以上，是目前肿瘤甲基化标志物检测研究的优选技术，应用场景包括肿瘤早筛、肿瘤诊断、个性化用药、实时监控、预后监测等。